Способ иммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот на полимерной подложке

(51)5 С 12 й ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФРАГМЕНТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ НАПОЛИМЕРНОЙ ПОДЛОЖКЕ(57) Использование: биотехнология, молекуеиооргантитут биякина лярная биология, медицина, Сущность изобретения: способ обеспечивает возможность иммобилизации на полимерную подложку коротких (до .20 нуклеотидных звеньев) фрагментов нуклеиновых кислот при сохранении ими способности образовывать прочные а, Н.Ю.Щер, В,В.Сабу- бов иоорганииоорганиРАНСиб,отд,1 - 87.гало.В. Р350-5354 че-, чеплементарные комплексы, В качестве полимернои подложки используют полимер, содержащий карбоксильные группы, которые активируют. превращением в хлорангидрид карбоновой кислоты, Во фрагмент нуклеиновой кислоты вводят аминоспейсер и процесс иммобилизации ведут в присутствии третичного амина,зан с твердои фазои, а другои, находящв растворе, несет репортерную грукачестве твердой фазы часто исполполимерные подложки, на которые имлизуют длинный фрагмент нуклеиновлоты. Однако полинуклеотиды облдвумя существенными недостаткасравнению с короткими олигонуклеми;медленная кинетика реассоциацилеиновых кислот, что увеличиваетпроведения гибридизационного анотсутствие способности выявлять повательности, отличающиеся точечнымлеотидн ыми заменами.Использование в гибрианализе иммобилизованных наподложки коротких олигонукл диздционном полимерные еотидов иск(21) 4922414/13(71) Новосибирский институт бской химии СО АН СССР и Инсганической химии им,М;М,Шем(73) Новосибирский институт бской химии СО РАН, Институт бской химии им, М,М,Шемякина(56) 1, Фругмарц Л,А. и др, ИзвСССР; сер,хим, наук, вып.1, с,82, АЫпе )-С, Кегпр 0.,)31Вам. Асад, Яс. ОЯА. 1977, 74, 5 Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии .и медицине. Оно может быть использовано в сэндвичгибридизационном анализе при выявлении определенных нуклеотидных последовательностей, для выделения индивидуальных нуклеиновых кислот и выявления точечных мутаций,Сэндвич-гибридизация - наиболее перспективный метод для анализа РНК и ДНК в неочищенных препаратах, в особенности разнородного клинического материала, содержащего белки, полисахариды и другие примеси, способные ингибировать сорбцию нуклеиновых кислот, Метод основан на использовании двух отдельных фрагментов нуклеиновых кислот, один из которых свяппу. В ьзуют мобиой кисадают ми по отидаи нуквремя элиза; следои нук 1808014лючается, так как отсутствуют методы присоединения их к подложке.Для ковалентного присоединения полинуклеотидов известны следующие способы; фотоиммобилизация и взаимодействие 5 с активированными электрофильными группировками, а именно с диазосоединениями,Метод фотоиммобилизации основан на взаимодействии с иммобилизуемыми молекулами высокореакционно-способных час тиц - нитренов, которые образуются в ходе облучения арилазидов полимерной подложки ультрафиолетовым светом, Однако под действием ультрафиолетового света, а также в результате реакции с нитренами, про исходит модификация гетероциклических оснований, Известно, что изменения в структуре даже одного основания приводят к утрате олигонуклеотидами способности образовывать прочные комплементарные 20 комплексы, Таким образом, фотоиммобилизация не может быть использована для присоединения к полимерным подложкам коротких олигонуклеотидов. 25 Наиболее близким к заявляемому является способ иммобилизации, основанный на взаимодействии нуклеиновых кислот с активированной электрофильной группировкой полимерной подложки, а именно с диазобензилоксиметилцеллюлозой. Взаи модействие арилдиаэониевой соли подложки с нуклеиновыми кислотами ведут в боратном буфере рН 8,0. При этом происходит взаимодействие экзоциклических аминогрупп нуклеиновой кислоты с диазогруппой 35 подложки и образуются соответствующие диазоаминосоединения, Вовлечение в реакцию важных для образования водородных связей аминогрупп гетероциклических 40 оснований, несомненно, отразится на способности коротких фрагментов нуклеиновых кислот к образованию прочных комплементарных комплексов. Таким образом, этот метод не может быть использован для присоединения к полимерным полож 45 мым способом иммобилизации фрагментов 55 НК, включающим активацию группировок полимерной подложки и их взаимодействие с фрагментами НК, при этом по 5-кондевому фосфату фрагментов предварительно вводят аминоспейсер, в качестве подложки кам коротких олигонуклеотидов,Целью изобретения является обеспечение возможности иммобилизации на полимерные подложки коротких (до 20нуклеотидных звеньев) олигонуклеотидов 50при сохранении ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы,Указанная цель достигается предлагаеиспользуют материал, содержащий карбоксильные группы, которые активируют превращением в хлорангидрид карбоновойкислоты с помощью пентанхлорида фосфора, а процесс их взаимодействия с фрагментами НК ведут в присутствии третичногоамина,Способ включает присоединение к олигонуклеотиду пол иметилен пол иамина путем взаимодействия одной из алифатическихаминогрупп с 5-фосфо-й,й-диметиламино 1пиридиниевым производным олигонуклеоти-да; активацию с помощью пентахлоридафосфора карбоксильной груплы полимерной подложки с образованием соответствующего хлорангидрида карбоновой кислоты;взаимодействие аминогруппы полиметиленполиаминового спейсера олигонуклеотида с активированной электрофильнойгруппой полимерной подложки в присутствии третичного амина, необходимого длядепротонирования аминогруппы спейсера.П р и м е р 1, Иммобилизация на лавсанрбАССТСТССАССТТСАТТ, 2 10 молей(2,9 оптических единиц при длине волны 260нм (ОЕ 2 во) 17-звенного олигонуклеотида переводят в цетавлоновую соль триметилцетиламмоний бромидом. Соль нуклеотидарастворяют в .50 мл диметилформамида,добавляют 25 мкл диметилформамида с3 10 молями (3,66 мг) 4-й,й-диметиламинолириина, 12,5 мкл диметилформамида с15 10 молей (3,93 мг) трифенилфосфинаи 12,5 мкл диметилформамида с 1,5 10молей (3,3. мг) 2,2 -дипиридилдисульфида.1Реакционную смесь выдерживают 10 минпри комнатной температуре, Полученноеактивное производное олигонуклеотидаосаждают 1 мл 2)ь-ного раствора перхлората лития в ацетона. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном,эфиром, сушат. К сухому остатку добавляют30 мкл водного раствора, содержащего3 10 молей (5 мкл) 1,10-диамино,7-диа эадекана, Выдерживают 60 мин при комнатной температуре, осаждают 1 мл 2-ногораствора перхлората лития в ацетоне, осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром, сушат,Полоску лавсана (15 хб мм) инкубируютпри комнатной температуре в насыщенномпентахлоридом фосфора растворе толуола(3 мл) в течение 5 ч, отмывают толуолом донейтральной среды (по 2 мл). Промываютй,й-диметилформамидом (2 х 1 мл) и переносят в раствор й,й-диметилформамида (400мкл) с цетавлоновой солью полученного, какописано выше, фосфамида олигонуклеотидатретичного амина, Реакцию ведут при комнатной температуре в течение 12 ч, Полоскупромывают 1 мл М,й-диметилформамида иопускают в 2 -ный раствор перхлората ли. тия в ацетоне, Через 15 мин полоску промывают водой (5 х 2 мл) в течение 60 мин,раствором 0,5 м КаС 1; 0,1 М Трис-НО рН 7,5;0,05 Твин(2 х 5 мл), затем водой (2 х 5),Хранят при -4 С, Количество присоединенного к лавсану олигонуклеотида оценивают,используя Р-меченный образец, Радиоактивность на лавсане детектируют просчетом в жидкостном сцинтилляционномсчетчике. Табл.1 иллюстрирует воспроизводимость способа иммобилизации олигонуклеотида на полимерную подложку,Для определения равномерности иммобилизации олигонуклеотида на поверхностьлавсана модифицированный лавсан разрезают на одинаковые полоски. Радиоактивность на полосках детектируется просчетомв жидкостном сцинтилляционном счетчике,Табл.2 иллюстрирует равномерность иммобилизации олигонуклеотида на поверхности полимерной подложки.Аффинность полученных материалов.определяют по способности связывать комилементарный (34-эвенный) и некомплементарный (17-эвенный) олигонуклеотиды,меченные э 2 Р,Вэаствор 1 М Нас, 0,05 М Трис-НС рН7,5 с Р-меченными 34-звенным олигонуклеотидом (1,2 10 молей) или с 17-звенным-1 голигонуклеотидом, аналогом иммобилизованному на лавсан,(1,4 10 молей) вносят-12полоски модифицированного лавсана, Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Отмывают по 25 мин раствором0,5 М ИаС 1, 0,1 М Трис-НС 1 рН 7,5, 0,050 Твин(Зх 1 мл). Связавшуюся радиоактивность просчитывают в жидкостном сцинтилляционном счетчике йас 1 Ьета ( КВ,Швеция), Комплементарный олигонуклеотид66 сдсссдбддстддтбддтбдд 66 т 66 д6 А 66 Т связывается с модифицированнымлавсаном, а некомплементарный АССТСТССАССТТСАТТ не связывается. Сорбционнаяемкость. аффин ной полимерной подложкипредставлена в табл.З.Способность образовывать иммобилиэованными олигонуклеотидами прочные,комплементарные комплексы оцениваютчерез сравнение температуры, при которойпроисходит денатурация комплекса, образованногоо олигонуклеотидом, иммобилизованным на поверхность полимернойподложки (рбАССТСТССАССТТСАТТ) икомплементарным олигонуклеотидом(66 САСССА 6 ААСТААТ 6 ААТ 6 АА 66 А 6 А 6 6 Т) с температурой плавления дуплекса, образованного данными олигонуклеотидами,в растворе,Кривые плавления комплементарных5 комплексов олигонуклеотидов записываютс помощью установки для исследованиятермической денатурации в ультрамикромасштабе на базе спектрофотометра "Обь 4" (НИБХ СО АН СССР) при концентрациикомпонентов 1,4 10 М в 0,6 М Нас,0,01М Трис-НС 1 рН 7,99, 0,01 М М 9 С 12,Термическую денатурацию на лавсановой полоске исследуют, используяэгР-меченный 34-звенный олигонукле-.отид, Аффинную лавсановую полоску(0,5 х 0,5 см).инкубируют в 0,1 мл раствора 1 М йаС 10,05 М Трис-НС рН 7,5; содержащем 2 10 молей РСАСССА 6 ААСТААТ 6 ААТ 6 АА 66 А 6 А 66 Т в течение 1 чпри комнатной температуре (25 С). Полоскуотмывают по 25 мин раствором 0,5 М час,0,1 М Трис-НС 1 рН 7,5, 0,050, Твин, переносят в раствор с 0,6 М Нас, 0,01 М трисНС рН 7,99, 0,01 М М 9 С 12, Растворравномерно нагревают в термостате от 25до 75 ОС. Через каждые 5"С отбирают супернатант и просчитывают в жидкостном сцинтилляционном счетчике ЯасЬеса ( КВ,Швеция). Температура плавления дуплекса,30. образован ного в растворе, 51,2" С. Темпе ратура денатурации дуплекса, образованногос олигонуклеотидом, иммобилизованном налавсане 51 С,П р и м е р ы 2, 3. Иммобилизация на35 лавсан рс 1 АССТСТССАССТТСАТТ.Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что использован лавсанразмером 0.9 см (пример 2) и 0,3 см (при 40 мер 3), Результаты по иммобилизации и характеристики аффинных подложекпредставлены в табл,1,2 и 3.П р и м е р ы 4 и 5, Иммобилизациянэ КМ-целлюлозу олигонуклеотидар 1 АС Стст С Сд С Стттсдтт,Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что использована вместо лавсанаКМ-целлюлоза размером 0,9 см в примере 450 и 0,3 см в примере 5, Результаты по иммобиглизации и характеристики аффинной подложки представлены в таблицах 1, 2 и 3.П р и м е р 6. Иммобилизация на лавсанрбААТССАСААТ 66 ТТССССА,Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что фосфамид олигонуклеотидадополнительно очищают обрэщенно-фазовой ВЭЖХ, Используют колонку (14,бх 2501808014 Таблица 1 Содержание нуклеотидного мате иэлаУдельнаярадиоактивность имп/минмоль х 10 Размер полоски полимерной подложки,см Счет радиоактивности проб по Черенкову, имп/мин Полимерная подложка0;9 0,3 967 249 71220 71220 7,145,6 1,4 1,1 2832 2,4 Лавсан 504 144 240 2,9 41388 4570 900 Лавсан 300 Таблица 2 нм) со смолой ОсЬгоовогЬ ВР(10 мкм) иградиент концентрации ацетонитрила от 0до 40 в 0,05 М С 04. Результаты по иммобилизации представлены в табл,1 и 2.П р и м е р 7. Иммобилизация на лавсан 5рдТТОТААССТТ.Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что фосфамид олигонуклеотидадополнительно очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ. Используют колонку(4,6 х 250 нм)со смолой ОсЬгозогЬ ВР - 18(1 0 мкм) и градиент концентрации ацетонитрила от 0 до 20 в 0,05 М ОСЮа, Аффинную емкость и спо- .собность к комплексообразованию оценивают, используя комплементарный(28-з вен н ый) ол и гонуклеотид - Рзарб С СТО О О САО ОТТО О ТАТСААООТТАСАА.Результаты по иммобилизации и характеристики аффинной подложки представлены в 20табл,1,2 и 3,Таким образом, предлагаемый способпозволяет присоединять к полимернымподложкам фрагменты нуклеиновых кислотс сохранением ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы,Полученным подложкам свойственна высокая аффинная емкость (до 10 молей/см ); Этих двух факторов достаточно, чтобы обеспечить возможность использования аффинных полимерных подложек в сандвич-гибридизационном анализе, также при выделении индивидуальных нуклеиновых кислот,Ф о р мул а и зоб рете н и я Способ иммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот нэ полимерной подложке, включающий активацию групп полимерной подложки и их взаимодействие с фрагментами нуклеиновых кислот, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения возможности иммобилизации на полимерной подложке коротких, до 20 нуклеотидных звеньев, фрагментов и сохранения ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы, в качестве подложки используют полимерную подложку, содержащую карбоксильные группы, активацию проводят с помощью пентахлорида фосфора до превращения кэрбоксильных групп в хлорангидрид кэрбоновой кислоты, перед иммобилизацией во фрагменты нуклеиновой кислоты вводят аминоспейсер, а процесс иммобилизации ведут в присутствии третичного амина,мин моль НК 4 КМ-целлюлоза. 0,250,25 307 328 277 240 260 220 504 504 504 Лавсан 0,25 0,25 0,25 27 28 29 4448 4470 4830 300 300 300 4570 4570 4570 Лавсан Таблица 3 Составитель Т.ГодовиковаТехред М.Моргентал Корректор . М,Самборская Редактор Заказ 1395 ТиражПодписное ВНИЙПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 7 8 9 10 11 1213 20 21 22 23 24 25 26 0,25 0,25 0,25 0,25 0,16 0,16 0,16 0,25 0,25 0,30 0,30 0,30 0,30 240 Счет радиоактивности проб по Черенкову, имп/мин 3258 3017 3065 3500 2507 2237 2289 366 360 407 341 320297 4016 Удельная радиоактивность, имп х х 10