Способ определения фракций уробилина в сыворотке крови

СОЮЗ СО 8 ЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 5601 М 3 1 НОЕ ПАТЕНТНОЕСССР ССР) ГО НИЕ ИЗОБРЕТЕУУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ О Т ия фракций уробилина в сыворотке крови, ущность изобретения: на фильтр иэ бумаги для электрофореза диаметром 25-30 мм, пропитанный в теченИе 10-15 мин 0,5 мл сыворотки крови, наносят 0,01 мл азотной кислоты желтого цвета от присутствия азотистой и по появлению в месте нанесения азотной кислоты бирюзовой окраски в первую минутусудят о присутствии Р-фракции, по появлению только пурпурной и фиолетовой окраски - 1-фракции, по появле- нию желтой - 1:уробилина (стеркобилина), по появлению окрасок: бирюзовой, за ней кольца пурпурно-фиолетовой, с последующим развитием желтой (в центре) судят о присутствии всех трех фракций.(72) УРО (57) индикация фракции только 1-уробилина и только в моче,За прототип предлагаемого изобретения взят способ, основанный на реакции окисления фракций уробилина хлорным железом, Он позволяет разделить фракции и, особенно, выделить фракцию Р-уробилина, которая, как установлено авторами, несет особую информацию для цели дифференциальной диагностики, в то время как содержание ее мало, и это самая неустойчивая иэ всех фракций. Этим вызвана некоторая ее недооценка в клинической практике. К основным недостаткам метода следует отнести следующие:метод требует предварительного осаждения билирубина с последующей длительной экстракцией фракций хлороформом, его выпаривание; время реакции 2,5-3 ч; регистрация результатов треооует специальной аппаратуры (спектрофотометр); для выполнения анализа требуется специалист средней или высшей квалификации,74817/14.М. Горский и К.В, Ильичевавторское свидетельство СССР 6245, кл. 0 01 И 33/72.ПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ ИЛИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ спользование: медицина, э именно исследовании биологических жидко- может быть использовано в лаборай диагностике, Цель изобретения - щение и ускорение способа разделезобретение относится к медицине, а име но к исследованиям биологических жид остей путем разделения фракуробилина,и может быть использовано в лабораторной диагностике.роблема разделения фракций уробилин традиционного трудная. До настоящеГо ремени нет экспрессного и простого мет да разделения фракций,К наиболее надежным и точным методам относят методы электрофореза с последукщей обработкой лент хлорным железом или хлоридом ртути. Методы требуют специальной аппаратуры и занимают 48 ч рабочего времени.Существует простой метод индикации, но ыделяется одна фракция и требует специального аппаратурного обеспечения, 1 Существует метод индикации 1-уробили 4 э в моче, Метод осуществляется путем дл тельного приготовления импрегнировань)х особым составом лент, с его помо цью может быть осуществлена 1793378 А 1Целью изобретения является упроще- хроматограмме важно расшифровать ее вние и ускорение способа.первые 5 - б мин. Первым в реакцию вступаПоставленная цель достигается следую- ет 1-уробилин. Появление лазурной окраскищим способом: на фильтр из бумаги для во внешнем кольце после пурпурно-фиолеэлектрофорезадиаметром 25 - 30 мм,пропи товой не свидетельствует о присутствиитанный 0,5 мл сыворотки крови в течениеэтойфракции,ахарактеризуетвысокийуро 10-15 мин, наносится 0,01 мм азотной кис- вень-уробилина.лоты желтого цвета от присутствия азоти- Ранее подобная реакция использовастой и по появлению на месте нанесения ласьвлабораторнойдиагностикеприисслекислотбирюзовойокраскивпервуюминуту 10 довании мочи на билирубин - проба судят о присутствии О-фракции, йо появле- Гмелина (Руководство по клиническим и ланию только пурпурной и фиолетовой акра- бораторным исследованиям, Медицина, М., ски - 1-уробилина, по появлению желтой - 1960, стр,375). Возможность индикации-уробилина (стеркобилина), при развитии фракций уробилина и стеркобилина с по- окрасок: бирюзовая, за ней - кольцо пурпур мощью этой реакцйи нигде не описана, что ной или фиолетовой с последующим появле- доказывает соответствие предлагаемого нием желтой (в центре) судят о присутствии способа критерию "существенные отличия", всех трех фракций.: : ,:.: .,: Способ осуществляется следующим обЕсли на пропитанную биологической разом: в центре фильтра непроклеенной бужидкостьюфйльтровальнуюбумагу(кругдиа маги диаметром 25 - 30 мм на столике с метром 25-30 мм) нанести 0,01 мл азотной уровнем(для равномерного пропитывания),кислоты с присутствием азотистой, в пер-.: находящимся в чашке Петри и предварицыеже 30 с на фильтре появляются концен- тельно смоченном дистиллированной вотрические кольца различной окраски,дой; наносят 0,5 мл сыворотки крови.Авторы данной. заявки впервые путем па Фильтр пропитывается ею 10-15 минут, по раллельно проведенного спектрального сле чего оставшаяся, не впитавшаяся сывоанализаустайовили,чтокаждомукольцуоп-:ротка крови,стряхивается о стенку чашки,ределенной окраски соответствует опреде- пропитавшийся таким образом фильтр по- ленная фракция уробилина илимещается на стекло(на столике с уровнем) в стеркобилина; .; .: .- З 0центр наносится капля азотной кислотыПервой вреакцию окисления вступает:. желтого цвета от присутствияазотистой,фракция О-уробилина, как самая неустойчи-, объем капли равен 0,01 мл. Азотная кислота вая, и дает кольцо-пятно лазурного цвета, в качестве окислителя вместо РеСз взята, соответствующее глаукобилину - конечно- как наиболее сильный и практически бесму продукту окисления фракции, если она 35 цветный окислитель, Объем сыворотки, присутствуетвсубстрате, Второй в реакцию окислителя и диаметр фильтра подобраны вступает 1-уробилин, если он присутствует, экспериментально. Ниже приводятся реи дает концентрическое кольцо пурпурно- зультаты этих экспериментов. Для анализа сиреневого, фиолетового цвета, соответст- выбрана непроклеенная бумага для электвующее виолинам, Кольца не смешиваются, 40 рофореза с характеристиками; масса 1 кв.м т.к. на такой"бумаге идетпостоянный форез245+15 г, толщина 44 М мкм, капиллярная от-центра к периферии, Последним - через всасываемость при поперечном направле-2 мин в центре развивается желтое пятйо нии 80+7 мм, впитываемость при погруже. -этостеркобилин;оннемигрирует,остава-нии менее 2 с. Все характеристикиясь в центре. При отсуФствии первых двух 45 приведены для воды. Приходится учитыфракций имеет место только желтое пятно вать, что при анализе сыворотки крови, состеркобйлина с белым концентрическим держащей крупные молекулы биологических кольцом вокруг. В сыворотке крови - это соединений, в частности пигменты - это цекоагулировавший белок. .лые цепи молекул "упакованные в особыеупаПри высоком уровне 1-уробилина на 8- 50 ковки", чтобы бумага пропитывалась10 мин реакцииво внешнем круге появляет- максимально, выбрано время 10 - 15 мин. По ся бирюзовыйили лазурный цвет - это истечении этого времени объем остаточной глаукобилин, полученный из виолинов при капли варьировал в пределах 0,02 - 0,15 мл, избытке окислителя или самого субстрата, что зависело от состава сыворотки. При вреНа 15 - 20 мин может появиться сине-голу мени, меньшем 10 мин, разброс остаточной бая окраска - это продукт окисления сво- капли значительнобольше(0,05-0.2).бодного билирубина. Чтобы этого избежать, Объем 0,01 м НЙОз определен путем , авторами подобраны объем сыворотки, вычисления,т.к.допустимыйуровеньсодерокислителя и диаметр фильтра, Для пра- жания фракций известен.вильной оценки фракционного состава поонцентрация 9-8,5 МНЙОз соответстконцентрированной кислоте. Коммерая кислота имеет плотность 1,405 г/см и соответственно концентю 61-680 пределы колебаний норностей при такой характеристике оляют 8,95-8,52. Авторы округлили это 8.5. Концентрация азотистой кислоты ределяется, поэтому указывается тольет (желтая от присутствия азотистой), ыбранный объем окислителя 0,01 мл, анесении его на фильтр, форезировал нтра на радиус 8 мм (диаметр круга до ) за 5 мин, на 6 мин этот круг начинал ться; улетучивалась вода, При нанесеэтого же обьема кислоты на фильтр, итанный дистиллированной, диаметр достигал 22 мм, о отдельных случаях . Так как объем и концентрация были вует ческ 1,37 рац мал сост до 9 нео коц 51015 при отц 16 м суж нии про круг 30 м уже фил 20 25 выбраны, то авторы остановились на тре с диаметром 25-30 мм.ри выборе обьема исследуемой жид 1 авторы исходили из следующего; конрация фракций уробилина очень низка. подтверждается имеющимися даннымл сыворотки крови о патологии могут имально содеркать 17,2 мкг фракции обилина, минимально - 5,2 мкг. Соотоенно в 0,5 мл - 1,72 мкг и 0,52 мкг. 30 ри низкой концентрации фракции, ее о не уловить, Если брать больший объо соответственно следует увеличить дир фильтра, обьем окислителя, а 35 овательно,и время реакции. Учитывая(а 6 - 7-ой минутах в реакцию вступают е пигменты - билирубин; биливердин, дополнительно новые цветные кольца, ение фореграммы с целью выделения нных уробилинов( и О) будет затруднеохранение же Диаметра фильтра и объокислителя при увеличении обьема ротки крови приведен только к увелию объема невпитавшейся сыворотки. 40 ак авторы стремились сократить объемедуемой жидкости, то выбрали его рав 0 5-ф.О 05 мл,исс нымВ центр пропитанной таким образом бум ги наносится капля аэотнои кислоты жел ого цвета от присутствия в ней азотисто и по появлению в ней концентрических кол ц последовательно; бирюзового, всех отт нков фиолетового, желтого (в центре) осе вместе или какой-то одной окраски судят присутствии всех вместе или какой-то одн й фракции.,Пример конкретного исполнения.1. Больной Калягин Т.Г 50 лет, ист. б-ни М ф 00, Диагноз: хронический персистирующйй гепатит, У больного из сыворотки кро 50 55 каст цен Это ми, мак О-у ветс Есл то и мож ем, аме сле что ноо аэт то ч ист но,взять объем сыворотки меньше 0,5 мп,ви, взятой в биохимическую лабораторию для планового лабораторного обследования, взяли 0,5 мл сыворотки крови, пипеткой нанесли ее на фильтр, находящийся на горизонтальном уровне, смоченный дистиллированной водой, Фильтр пропитывался 10 мин, Невпитавшуюся сыворотку крови стряхивают о край, фильтр в строго горизонтальном положенйи (по уровню) помещают на стекло, в центр наносят 0,01 мл окислителя.По истечению 1 мин в центре появился ровный желтый круг с белвы ореолом (коагулировавший белок); 5 мин - картина та же, но ярче, 10 мин - картина таже. Т.е, в данной пробе сыворотки крови фракции - и О-отсутствуют, а есть только стеркобилин (физиологическая норма). Спектральный анализ этой же пробы дал результат: стеркобилин 1000 ь;уробилин 00; О-уробилин 00 ь.2. Больная Киселева Т,П., 58 лет, ист. б-ни М 1162. Диагноз: вирусный гепатит. Из сыворотки крови больной, взятой для планового лабораторного обследования взяли 0,5 мл сыворотки, пипеткой нанесли на фильтр, смоченный дистиллированной водой, находящийся в чашке Петри на горизонтальномуровне. Фильтр пропитывается 10 мин, неопитавшуюся сыворотку крови стряхивают окрай чашки, фильтр в строго горизонтальном положении (по уровню) помещают на стекло, в центр его наносят 0,01 мл окислителя, и в первь 1 е же секунды появляется розовое пятно (мезобилиродин), второе коп ьцо фиолетовое (мезобиливиолин), через 1 мин в центре желтое пятно, вйешне кольцо фиолетовое; 3 мин - та же картина, но ярче, на 5-ай минуте картина сглаживается, но появляется кольцо билирубина (общего). У данной больной вирусный гепатит, для которого характерно повышеннОе содержание -уробилинэ, который в процессе окйсления дэл кольцо мезобилиродина и меэобиливиолина, и повышенное содержание стеркобилина (желтое пятно). Данные спектрального анализа; стеркобилин 450; -уробилин 550; О-уробилин 0;3. Больной Бусыгин И.Ф., 66 лет, ист.б-ни М. 1245. Диагноз: первичная В 1 печени, В процессе планового лабораторного обследования взято из вены 2 мл крови, путем центрифугирования получена сыворотка крови и 0,5 мл ее нанесены на фильтр, смоченный дистиллированной водой, расположенный в чашке Петри на строгогоризонтальной поверхности, через 10 мин невпитаошаяся сыворотка стряхивается о край чашки, фильтр помещается на стекло, расположенное на горизонтальной поверхности и в центр фильтра вводится 0,01 мл окислителя, В первые секунды появляется1793378 30 Формула изобретения Сравнительнаятаблица прототипа и предлагаемого метода разделения фракций 1,- 1-, О-уробилинаМетодический прием Предлагаемый метаПрототип 11. Забор крови2. Получение сыворотки крови3. Исследуемый объем пробы4, Исследование в пробирке5, Исследование на бумажном фильтре6, Осаждение билирубина7, Центрифугирование осадка8, Забор цантрифугата а Лалиталанулгво,: Да Да 0,5 мл Да Нет Нет НетДа Да 5 мл Да Да Да Да бирюзовая окраска, к 30 с она становитсялазурно-бирюзовой (глаукобилин), 1 мин -окраска еще ярче, а круг больше, на 2-ойминуте появляется фиолетовое кольцо (мезобиливиолин), а в центре желтое пятно. К 55-ой минуте преобладает круг лазури с бирюзовой, узкое кольцо фиолетового цвета ив центре небольшое желтое пятно, У больного преобладает фракция О-уробилина(продукт его окисления - глаукобилин), Зна-. 10чительно меньше фракции 1-уробилин (присутствие мезобиливиолина), желтое пятно -стеркобилин, Результат спектрального анализа: стеркобилин 25 О; 1-уробилин 27; Оуробилин 48 О, 15Таким образом, в трех сыворотках крови предложенным способом разделеныфракции уробилина, в первом только стеркобилин, во втором - 1-уробилин и стеркобилин и в третьем все три фракции - 1, 20О-уробилин и стеркобилин,С помощью описанного способа проведения меэобиливиолиновой реакции на бумажном фильтре обследована сыворотка крови,В группы обследуемых вошли: 25доноры 20,больные 125. Способ определения фракций уробилина в сыворотке крови, включающий проведение мезобиливиолиновой реакции, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, берут бумажный фильтр диаметром 25-30 мм, который пропитывают в течение 10-15 мин сывороткой крови в объеме 0,5 мл с последующим нанеПолучены следующие результаты: у 20 доноров из 20 на фильтре развивалось только желтое пятно, в тех же образцах сыворотки крови методом спектральной оценки мезобиливиолиновой реакции в 20 случаях зафиксировано 100 оуь содержание стеркобилина. У больных в 55 случаях развивались красно-фиолетовое кольцо и желтое пятно, что свидетельствует о присутствии 1-уробилина и стеркобилина, В тех же случаях спектральный анализ показал присутствие 1-фракции и стеркобилина, их процентное соотношейие колебалось в разных пределах. У 50 больных на фильтре зафиксировано от центра и периферйи желтое пятно, изумрудно-голубое, красное, фиолетовое, что говорит о присутствии фракций 1-, О- и стеркобилина. Их соотношение, как правило, по данным спектрального анализа составило по 30-35 процентов. У 20 больных в первые же секунды на фильтре развивалась изумрудно-голубая окраска, затем она растекалась кольцом вокруг желтого пятна, что говорило о присутствии фракции О-уробилина и стеркобилина, Спектральный анализ показал их разное процентное соотношение. сением в центр фильтра 0,01 мл концентрированной азотной кислоты с примесью азотистой кислоты и при появлении в течение первой минуты бирюзовой окраски судят о присутствии О-уробилина, желтой - 1-уробилина, пурпурной и фиолетовой - 1-уробилина, а при последовательном появлении бирюзовой, пурпурной, фиолетовой и желтой окрасок судят о присутствии всех трех фракций уробилина.10 1793378 Продолжение таблицы 18. 1-уробилин19 В емя еак ии 650 нм оЗч Составитель Т, Малютина Ре актор Т. Никольская . Техред М.Моргентал Корректор Н. СлободяникЗаказ 502 Тираж. Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 45 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 19, Экстракция пигментов СНСз10. Получение сухого осадка пигментов11. Растворение его в С 2 Н 50 Н12. Нанесение (добавление) окислителя13. Термостатированная водяная баня14. Регистрация результата15, Контроль16.-уробилин17.-уробилин Да Да . Да Да ДаСФЕсть490 нм560 нм Нет Нет Нет Да НетВизуальлно .:,Нет: ,:.Желтое пятно " Кольца розового, и красйого и фиолетового цветовБирюзовое кольцо15 мин