Ингибитор рнк-геномных бактериофагов

(я)ю С 12 Й 9/ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ИСАНИ ЗС)Б ИДЕТЕЛ ЬСТВУ ВТОРС КОМ ый универси- (ЯО) и ЛейпМаркса (ОО) рийова, М; Н. А. Рокштро и 4 арственнва-Ленина им, Карла Ф,Р.Ша Штенц,риофаги, МИност(46) 15.12.92. Бюл. М (71) Казанский госуд тет им, В. И. Ульяна цигский университет (72) И, Б. Лещинская, Филимонова (ЯО), Э 3. Клуге (ОО) (56) Адамс М., Бакте ная литература, 1961Авторское свиде М 1314670, С 12 й 9 Изобретение относится к области мик-робиологической промышленности и биотехнологии и может быть использовано длязащиты бактериальных штаммов, используемых в производственных процессах от.бактериофагов, вызывающих лиэис культур,До сих пор не существует надежногоспособа борьбы с бактериофагами в микробиологическом производстве. Стерилизация производственных биореакторовявляется дорогостоящей, сложно реализуется и не обеспечивает полной гибели бактериофагов,Целью изобретения является повышейиеэффективности борьбы с РНК-содержащимибактериофагами в микробиологическомпроизводстве,Поставленная цель достигается прйменением в качестве ингибиторов РНК-геномных бактериофагов препаратов нуклеаз,обладающих РНК-деполимеразной актив 2(57) Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность. Сущность изобретения; для борьбы с РНК-геномными бактериофагами в микробиологической промышленности и биотехнологических экспериментах предложены нуклеазы, обладающие ДНК-полимераз-. ной активностью, в качестве последних могут быть использованы как панкреатические дезоксирибонуклеаэы и рибонуклеазы, а также зндонуклеазы и рибонуклеазы бактериального происхождения. 4 табл,ностью. Принципиально новые биогенные ингибиторы обладают широким спектром действия по отношению кразличным группам бактериофагов и представляют собой нетоксичные экологически чистые вещества, безвредные для производственных штаммов бактерий.Нуклеазы - белковые ферментные пре параты с высокой каталитической активностью и способностью к неспецифическому расщеплению РНК по эндонуклеолитическому механизму до олиго-, три-, ди- и мононуклеотидов, в связи с чем эти ферменты способны ингибировать различные РН К-геномные бактериофаги, например фаги М 12, 1 2 и ОВ Е соИ, а также фаг РР 7 Рзецботопаз аег 091 поза. Добавление ферментов в питательную среду в количестве 2-12 мкг/мл (4000 - 5000 ед/мл) практически полностью подавляет развитие фаговой инфекции, не влияет на10 15 20 25 центрация фермента в агаре, при которой еще происходит образование негативных 30 ния негативных колоний, Были получены широкие зоны ингибиро 35 вания, свидетельствующие о том, что препаракоторые образуются в зонах диффузии ферментов.Действие РНКаэы В 1 на РНК-содержа щие бактериофаги(метод лунок) показаны втабл, 1.Изучение фагоингибирования препаратов нуклеаз в концентрациях, соответствующих одинаковой каталитической активности 45 показало (табл. 2), что РНКазы В 1, А Ва инуклеаза Ят в условиях, когда ферменты диффундируют из лунок в агаре, образуют зоны ингибирования 7,4. Антифаговое дей- Ствие нуклеаз на примере системы М 50 12/Е,соИ Иl 1665 Р+ (метод лунок) показанов табл. 2.7,1, 6,2 и 4,7 мм соответственно, тогдакак ДНКаза 1, неспособная к разрушениям РНК, не влйяет на РНК-геномные бактериофаги, Пример 2 свидетельствует, что для фагоингибирования ферменты должны обладать РЕК-деполимеразной активностью.В табл. 3 представлены результаты определения МКИ для РНКазы В 1 с использованием четырех фаговых систем. Показано,М 12 / Е,соИ Я 1665 Г12/ Е,со К 1046СВ ( Е,соИ АВ 301РР 7 / Рз.аего 91 позаИнгибиторная активность нуклеаз в.от ношении бактериофаговойределялась с помощью луночного метода и методом определения минимальной концентрации ингибированйя в чашках Петри с двухслойным агаром. рост и размножение бактерий и, следовательно, на количество и качество целевыхмикробных продуктов и является экологически безопасным.Использовали следующие нуклеазы;Рибонуклеаза Вас 1 из 1 меггпесИоз(Биназа, РН Каза В 1, ЕС 3,1,27,2) представляетсобой термостабильйый Фермент - эндонуклеазу, препарат которой имеет удельную активность - 1,3 х 10 ед/мг белка.6Ферментный препарат выпускается наЭкспериментальном биотехнологическомпроизводстве ИОС АН Лэтв, ССР по разра ботанному нами способу,Рибонуклеаза ВэсИоз ату 1 оПцое 1 эс 1 епз(Барназэ, РЙКаэа Ва, ЕС 3,1,27.2) представляет аналог РЙКазы В 1 и производится натом же заводе. Удельная активность препарата бэрназы составляет 2,6 х 10 ед/мг6белка.Эндонуклеаза Яеггата гпагсезсепз (Эн"донуклеаза Ят, ЕС 3.1,30,2) представляетсобой термолабильный фермент -эндонуклеазу, атакующую ДЙК и РЙК, Удельная активность препарата составляет 0,35 х 106ед/мг белка. Препарат производится на Вышнеполоцком заводе ферментных препаратов Миймедбйопрома СССР.Рибонуклеаза панкреатическая (РНКаза А; ЕС 3.1.27.5), коммерческий ирепарат,йройзводимйй на Ленинградском фармзаводе, Представляет собой фермент, расщепляЮшбий РНК с удельной активностью0,35 х 10 ед/мг белка,Дезоксирибонуклеаза панкреатическая(ДН Каза 1, ЕС 3.1.21.1), коммерческий препарат, производимый на Ленинградскомфармэаводе. Представляет собой белковыйферментный препарат, расщепляющийтолько ДХК с удельной активностью 0,5 хх 10 ед/мг белка.Все исследуемые ферменты - белки, которые быстро разлагаются"вприроде, поэтому экологически безопасйы, нетоксичныдля человека, животных, растений.ПрЬтивофаговое действие препаратовбыло испытано в отношении РНК-содержащих бактериофагов Е, соИ и Рз. аегц 91 позэсисполь"зо"вани"емследующи"сйстем: " При луночном методе в верхний питательный слой вносились бактерии и соответствующие бактериофаги, а в лунки (Д=10 мм) добавляли 0,05 мл ферментного раствора. Чашки инкубировали 24 ч при 37 или 28 С (Е.соИ и Рз,эегц 91 поза соответственно). В направлении градиента диффузии ферментов образовывались радиальные зоны ингибирования фагов, в которых отсутствовали зоны фаголизиса бактерий (негативные колонии или "бляшки" ), Средние значения зон ингибировэния получали не менее чем из 9 повторностей.Для определения оптимальных доэ препаратов нуклеаз методом минимальных концентраций ингибирования (МКИ) в верхний агаровый слой вносили бактериофаги, бактерии и ферментные препараты в разных концентрациях. После инкубирования в течение 24 ч при 37 (28 ОС) определяли процент ингибирования путем сравнения числа образованных негативных колоний с числом таких колоний в контрольных чашках, в которые фермент не вносили, Конечная конколоний, считается минимальной концентрацией ингибирования. Результаты показали, что предлагаемые в качестве ингибиторов препараты нуклеаздействуют на все изучаемые бактериофаги,а именно препятствуют процессу образоваты действуют в очень низких концентрациях,1781295 Таблица 1 Таблица 2 что МКИ РНКазы В в отношение бактериофагов М 12,2 и РР 7 приблизительно составляет 0,6 мкг/мл агаризованной среды, что соответствует 800 - 1000 ед/мл, Фаг ОВ более устойчив к действию РНКазы, поскольку фермент в концентрации, соответствующей 780 ед/мл способен ингибировать его только на 37. Поэтому МКИ для этого фага выше и соответствует активности РНКазы около 7800 ед/мл.Для сравнительной характеристики препаратов использовали такие их концентрации, при которых РНК-деполимеразная активность, рассчитанная на 1 мл агаризованной среды была одинаковой. Результаты представлены в табл, 4,установлено, что разные препараты нуклеаз в концентрациях, соответствующих одинаковой РНКазной активности, оказывают приблизительно одинаковое противофаговое действие. МКИ препаратов РНКазы В, РНКазы Ва, РНКазы А и нуклеазы Яв соответственно составляют: 3,0, 2,0, 12,0 и 12,0 мкг/мл.Как следует из табл. 1-3, ни в одном из случаев препараты нуклеаз не оказывали вредного влияния на размножение, рост и развитие бактерий-хозяев,Проведенные эксперименты с нуклеазами, выделенными из разных штаммов В.птегпзебцэ (4 штамма) и Я, гпагсезсепэ (3 штамма), а также РНКазой А, свидетельству ют, что источник получения фермента неоказывает влияния на его ингибирующую активность. Вероятно, любые РНКазы обладают ингибирующим действием в отношение РНК-содержащих фагов, причем 10 степень ингибирования зависит от ферментативной актибности препаратов, а также в определенной степени от сложности строения фага, Так, к примеру, наиболее устойчивым к действию нуклеаз оказался фаг ОВ 15 Е.со, для полного ингибирования роста которого необходимо 7000-8000 ед любого из исследованных ферментных препаратов, т,е. вдвое больше, чем для остановки роста других бактериофаго в.20 Проведено также изучение действия перечисленных нуклеаз, включая панкреатическую ДНКазу, на ДНК-геномные фаги Е.со, В.зиЬэ, Рз.аегидпоза, Рэ.йоогезсепз. Ингибирующего действия не проявил ни один 25 из исследуемых ферментных препаратов,Формула изобретения1781295В Таблица 3 Определение минимальных концентраций ингибирования (МКИ) препарата РНКазы В для РНК-содержащих бактериофагов,ЬБакте ио аги М 12/ Е.соП2/ Е.соИ РР 7/Рз,аегцд 1 поза429 33 89 37 86 98 0 0 0 0 0,06 (78) 653 . 12 309 71 0 0 0 Контроль без фермента Количество бляшек311 683 113 26 Таблица 4 Определение минимальных концентраций ингибирования пРепаратов нуклеаз на примере фага М 12, Концентрация РНКазы в агэризованной среде,мкг/мл (ед/мл) Количествобляшек Ингибирование фагов, % Ингибирование бактерий Количествобляшек Ингибирование фагов, % Ингибирование бактерий Количествобляшек Ингибирование фагов, % Ингибирование бактерий10 1781295 Продолжение табл. 4 ктор Тираж Подписноеосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раущская наб 4/5 Про ательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ствен каз 4256 ВНИИПИ Г оставитель ф. Шехред М.Морген рипова Корректор С. Патруш