Способ анализа гистологических микропрепаратов

, ррду: у"(. ИДЕТЕЛ ЬСТВУ КО К АВ Изо частност венного ва люм методом логии, м исследо ратов хожде Г ОСУДАРСТВГ 5 9 ЬИ КИЛИ ТГТГ 10 ИЗОБРЕТГНИ 5 РЛ И ОТ КР 11 ТИЯЛГ 1 РИ ГКНТ СССР(71) Саратовский государственный медицинский институт и Бюро судебно-медицинской экспертизы Саратовского областногоотдела здравоохранения(56) Макаров В.И. Дифференциальная диагностика кровоподтеков и трупных пятен, выявляемых в посмертно-измененной трупнойкоже. - Сб, Лабораторные исследованияобъектов судебно-медицинской экспертизы. Горький, 1985, с. 77,Карнаухов В,Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки, М,: Наука, теоретическая и прикладная биофизика,1978, с, 93-94,(54) СПОСОБ АНАЛИЗА ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к медицине, вчастности к способу определения количественного содержания органических веществ бретение относится к медицине, в и к способу определения количестсодержания органического вещестинесцентно-микроскопическим , и может быть использовано в биоедицине и судебной медицине для вания гистологических микропрепагких тканей биологического проися. Известен способ изучения гистологических микропрепаратов для дифференциальной диагностики кровоподтеков и трупных пятен по характерной картине различного люминесцентномикроскопическим методом, Сущность изобретения заключается о определении количественного содержания нуклеиновых кислот люминесцентно- микроскопическим методом с помощью регистрации максимальной величины люминесценции гистологического микропрепарата, окрашенного с использованием специфической люминесцентной метки - красителя этидиум бромида. Новым в способе является возможность определения посмертного или прижизненного происхождения кровоизлияний в коже волосистой части головы человека по установлению количественного содержания нуклеиновых кислот с учетом факторов, влияющих на интенсивность люминесценции - толщины гистологического среза, аутолитических процессов и с учетом индивидуальных особенностей люминесценции тканей с помощью установления величины интенсивности люминесценции эталона, в качестве которого используется урановое стекло. 1 з. и. ф-лы. 1 табл. спределения крови в посмертно измй трупной коже. 3 ъНедостатком этого способа является невозможность определения в гистологических микропрепаратах кожи количест- в венного содержания органического вещества в области кровоизлияний с учетом влияния аутолитического процесса, развивающегося посмертно в биологических объектах, что в совокупности делает невозможной дифференциальную диагностику прижизненно и посмертно возникающих в коже кровоподтеков.Наиболее близким по.технической сущности к заявляемому является способ определения содержания нуклеиновых кислот люминесцентно-микроскопическим методом, заключающийся в регистрации с помощью измерительного прибора, соединенного с фотоэлектронным умно- жителем, фотометрической насадки люминесцентного микроскопа, величины интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата, окрашенного с использованием специфической люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, при длине волны, соответствующей, максимальной величине интенсивности люминесценции примененного красителя, При этом толщина фотометрируемого участка гистологического микропрепарата считается величиной постоянной,Однако известный способ имеет следующие недостатки. Практика опредеЛения содержанля нуклеиновых кислот в гистологических микропрепаратах биологических объектов показывает, что на величину интенсивности люминесценции в значительной степени оказывает влияние толщина гистологического среза которая является неравномерной, при этом увеличение толщины гистологического микропрепарата сопрбвокдается усиленйем интенсивности люминесценции. Это приводит к тому, что при йзмерении интенсивности люминесценции определенной структуры микропрепарата величина ее имеет. различное значение, обусловленное неодинаковой толщиной среза, при одинаковом количественном содержании нуклеиновых кислот, На величину интенсивности лЮминесценции оказывает влияние также индивидуальная особенность строения различных органов и тканей, обусланливающая различную степень интенсивности люминесцен"ции при наличии одинакового количества вОпределенных структурах нуклеиновых кислот, и, кроме того, развитие аутолитическо го процесса в посмертно измененной тканиуменьшает интенсивность люминесценции при прочих равных условиях, Таким образом, указанные недостаткй в совокупности снижают точность и в большинстве случаев делают невозмокной оценку количественного сОдержания нуклеиновых кислот в гистологических микропрепаратах кожи при использовании укаэанного метода, что затрудняет анализ полученных результатов при их сопоставлении и физиологическую трактовку изучаемых явлений, а также препятствуют установлению характерат (посмертного или прижизненного) происхождения кровоизлияний в кожеголовы человека,Цель изобретения - установление характера кровоизлияний в коже волосистой5 части головы человека и повышение точности анализа за счет исключения влиянияаутолитического процесса в анализируемоммикропрепарате,Поставленная цель достигается тем, что10 в способе определения нуклеиновых кислот алюминесцентно-микроскопическимметодом, заключающемся в регистрации спомощью измерительного прибора, соединенного с фотоэлектронным умножителем,15 фотометрической насадки люминесцентного микроскопа, величины интенсивностилюминесценции гистологического микропрепарата, окрашенного с использованиемспецифической люминесцентной метки 20 красителя этидиум бромида, при длине волны, соответствующей максимальнойвеличине интенсивности люминесценциипримененного красителя, устанавливаютоптическую плотность исследуемого уча 25 стка гистологического микропрепарата,условно принимая ее за толщину фотометрируемого участка, при этом используют монохроматическое излучение, полученное спомощью монохроматора, длина волны ко 30 торого составляет 420 нм, что устанавливают по спектру поглощения использованнойлюминесцентйой метки-красителя, для получения сопоставимых результатов при исследовании различных участков кожных35 покровов от разных субъектов, имеющихзначительные колебания величины интенсивности люминесценции, обусловленныеиндивидуальными особенностями строения, пр именя ют эталон с постоя н ным спек 40 тром люминесценции, в качестве которогоиспользуют величину части светового потока уранового стекла ЖСтолщиной 1,5мм с длиной волны пропускания, равной 572нм, нормируют величину интенсивности лю 45 минесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величинеинтенсивности люминесценции эталона и.по полученному отношению рассчитываютколичественное содержание нуклеиновых. 50 кислот в условных единицах, устанавливаютколичественное содержание нуклеиновыхкислот в трех участках гистологическогомикропрепарата с наибольшей степеньюинтенсивности люминесценции с помощью55 визуальной микроскопии, принимают во,внимание наибольшее значение из трехполученных результатов для исключенияфактора влияния аутолитического процессаи повышения точности анализа, полученноезначение сравнивают с данными таблицыурановое стекло, нормируют величину интенсивности люминесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величине интенсивности люминесценции эталона и по полученному отношению рассчитывают количественное содержание нуклеиновых кислот в условных единицах, определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в трех участках гистологического микропрепарата с наибольшейстепенью интенсивности с помощью визуальной микроскопии, наибольшее значение из трех полученных результатов применяют в качестве критерия для установления характера кровоизлияния, что исключаетвлияние аутолитического процесса в анализируемом микроФрепарэте и повышает точность анализа, с привлечением таблицы соответствия решают вопрос о посмертном . или прижизненном развитии тестируемыхкровоизлияний в коже волосистой части головы человека.Способ реализуется следующим образом,Гистологические микропрепараты кожи волосистой части головы человека, симметричные области кровоизлияния, окрашенные с помощью люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, помещают на предметный столик люминесцентного микроскопа, снабженногофотометрической приставкой с объективом, 10", устанавливают зонд диаметром 0,1 мм. Возбуждают люминесценцию, находят нужный участок фотометрии, прикрывают полевую диафрагму и производят регистрацию величины интенсивности люминесценции с длиной волны 590 нм с помощью измерительного прибора,.соединеннога с фотоэлектронным умножителем фатомо-.рической насадки, Регистрируют 11 - величину прошедшего через участок фотометрии светового потока с длиной волны 420 нм, отображенную на шкале измерительного прибора: регистрируют Ь величину светового потока, прошедшего че 152030354055 соответствия и решают вопрос о посмертном или прижизненном развитии тестируемых кровоизлияний в коже волосистой части головы человека.Сопоставительный анализ заявляемогорешения с известным показывает, что заявляемый способ анализа гистологических микропрепаратов отличается от известноготем, что определяют величину оптическойплотности фотометрируемого участка гистологического микропрепарата, условно принимаемую за его толщину, определяют величину интенсивности люминесценции эталона, в качестве которого используют рез участок, расположенный рядом со сре.зом, с длиной волны 420 нм и по известной формуле определяют величину оптическойоплотности (О): О = 1 д . , Регистрируют величину интенсивности люминесценции эталона - уранового стекла, ЖСтолщиной -1,5 мм с длиной волны пропускания 572 ем, Нормируют величину интенсивности люминесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величине интенсивности люминесценции эталона и по полученному отношению рассчитывают колйчественное содержание нуклеиновых кислот в условных единицах. Определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в трех участках гистологического микропрепарата с наибольшей степенью интенсивности люминесценции с помощью визуальной микроскопии и наибольшее значение из трех полученных результатов используют в качестве критерия для установления характера кровоизлияния и решают вопрос о посмертном или прижизненном развитии тестируемых кровоизлияний в коже волосистой части головы человека согласно таблице соответствия.Предлагаемый способ анализа гистологических микропрепаратов может быть реализован с помощью любого люминесцентного микроскопа, снабженного фото- метрической насадкой с фотоэлектронным умножителем, соединенным с измерительным прибором (например, микроамперметром) и с применением устройства любого типа, позволяющего получать монохроматическое излучение (монохроматора).Использование предлагаемого способа наиболее эффективно для исследования кожных покровов, полученных в первые сутки после смерти.П р и м е р 1. Гистологический микропрепарат кожи волосистой части головы человека, симметричный области кровоизлияния, окрашенный с использованием люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, помещают на предметный столик люминесцентного микроскопа "ЛЮМАМ-И", снабженного фотометрической насадкой ФМЭЛс фотоэлектронным умножителем ФЭУ, соединенным с микроамперметром. Возбуждают люминесценцию, находят сосочковый слой дермы кожи, прикрывают полевую диафрагму и ироизводят регистрацию величины интенсивности люминесценции с длиной волны 590 нм с помощью микроамперметрэ, которая составляет 31. Величину оптической плотности определяют при использовании длины волны 420 нм,степенью интенсивности люминесценции с помощью визуальной микроскопии. Определяют копицественное содержание нуклеиновых кислот в первом. участке из области сальных желез кожи (при этом величина интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата составляет 60,- 75, 1 О - 95, величина оптической плотности 0,103; величина интенсивности люминесценции эталона - 47), которое составляет 12,39 усл,ед. Определяют количественное содержание нуклеиновых кислот во втором участке сальных желез кожи(при этом величина интенсивности люминесценции гистологического микропрепарэтэ составляет 59, 11 - 72, 1 О - 95, величина оптической плотности - 0,120, величина интенсивности люминесценции эталона - 47), которое составляет 10,46 усп. ед,Определеяют количественное содержание нуклеиновых кислот в третьем участке сальных желез кожи (при этом величина интенсивности люминесценции гистологического микропрепэрэтэ составляет 42, 1 - 75, 1 О - 95, величина оптической плотности - 0,103, величина интенсивности люминесценции эталона - 47), которое составляет 8,67 усп. ед, Наибольшее значение из трех полученных результатов - 12,39 усп. ед. - используют в качестве критерия дпя установления характера кровоизлияния, сравнивают с таблицей соответствия и устанавливают, что данное значение более 11,41 усп, едчто позволяет решить вопрос о прижизненном развитии кровоизлияния в коже волосистой части головый человека.Использование предлагаемого способаанализа гистологических микроп репаратов позволяет определять количественное содержание нуклеиновых кислот в кожных покровах в условных единицах и обеспечивает возможность получения сопоставимых результатов при исследовании различных структур гистологического микроп репарата, 5 повышает точность анализа зэ счет исключения влияния аутопитического процесса в анализируемом микропрепэрате, а также позволяет устанавливать посмертный или прижизненный характер развития кровоиз лияний в коже волосистой части головы че-.ловека, что имеет большое значение в связи с особой важностью решения этого вопроса в экспертной практике.Формула изобретения 5 1. Способ анализа гистологических микропрепаратов, включающий определение содержания нуклеиновых кислот путем регистрации величины интенсивности люминесценции микропрепарата, окрашенного с использованием люминесцентной меткиг 1 олученной с помощью монохроматорэспектрофотоколориметра "СПЕКОЛ". Затемрегистрйруют на шкале микроамперметра11, которое составляет 79, и 10, которое составляет 124, и по известной формуле определяют величину оптической плотности,которая составляет 0,196. Регистрируют величину интенсивности люминесценции эталона (уранового стекла ЖСтолщиной1,5 мм с длиной волны пропускания 572 нм), 10которая составляет 48. Нормируют величину интенсивности люминесценции участкасосочкового слоя дермы кожи (31) к величи- .не оптической плотности (0.196) и величинеинтенСивнбсти люминесценции эталона(48) 15; и рассчитывают количественное содержание нуклеиновых кислот в данном участке.которое составляет 3,29 усл, ед, Определяютколичественное содержание нуклеиновых кислот во втором участке соцкового слоя 20дермы кожи (при этом велицина интенсивности люминесценции гистологическогомикропрепарата составляет 31, 1 - 81, 1, "124, величина оптической плотности - 0,185,величина интенсивности люминесценции 25эталона - 48), которое составляет 3,49 усл,ед,Определяют количественноесодержание нуклеиновых кислот в третьем участкесосочкового слоя дермы кожи (при этом величина интенСивности люминесценции гистологического микропрепарата составляет36, 1 - 80, 1 О - 124, величина оптицескойплотности - 0,190, величина интенсивностилюминесценции эталона - 48), которое составляет 3,95 усл. ед, Для определения количественного содержания нуклеиновыхкйсйот "используют три участка сосочковогослоядермы гистологического микропрепарата кожи с наибольшей степенью интенсивности люминесценции с помощьювизуальной микроскопии. Наиболее значение из трех полученных результатов (3,95усл. ед,) используют в качестве критерия дляустановления характера кровоизлияния 4сравнивают с таблицей соответствия и устанавливают, что данное значение менее 4,68усл, ед., что позволяет решить вопрос о посмертном. происхождении кровоизлияния вкоже волосистой части головы человека, 5П ри м е р 2, Гистологический микропрепарат кожи волосистой части головы человека, симметричный области кровоизлияния,окрашенный с использованием люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, 5исследуют с помощью указанной установки,Производят изучение и анализ количественного содержания нуклеиновых кислот в трехуцастках гистологического микропрепаратаиз области сальных желез с наибольшей10 1749794 Количественное содержание нуклеиновых кислот в словных е ини ахУчасток фотометрии гистологического микропрепарата кожи волосистой части головы человекаБолее 10,67 Более 11.41 Более 12,20 Менее 4,68 Менее 4,38 Менее 5,19 Сосочковый слой дермы кожи Сальные железы кожи Потовые железы кожи Составитель О.ПалимпсестоваТехред М.Моргентал . Корректор М,Демчик Редактор. В.Данко Заказ 2591 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 красителя этидиум бромида, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью установления характера кровоизлияний в коже волосистой части головы человека и повышения точности анализа за счет исключения влияния аутолитического процесса в анализируемом микропрепарате, измеряют величину оптической плотности исследуемого участка гистологического микропрепарата кожи с использованием монохроматического излучения с длиной волны 420 нм, нормируют величину интенсивности люминесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величине интенсивности люминесценции эталона, в качестве которого применяют урановое стекло ЖС, толщиной 1,5 мм, но полученному отношению рассчитывают количественное содержание нуклеиновых кислот в условных единицах и, используя полученное содержание нуклеиновых кислот в качестве критерия для установления характера кровоизлияния с 5 привлечением таблицы соответствия. реша-,ют вопрос о посмертном или прижизненном развитии тестируемых кровоизлияний в коже волосистой части головы человека,10 2, Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в трех участках гистрлогического микропрепаратэ с наибольшей степенью интенсивности лю минесценции с помощью визуальноймикроскопии и для сравнения с таблицей соответствия применяют наибольшее значение из трех полученных результатов. Посмертные кровоиз- Прижизненные кроволияния излияния