Способ подавления репродукции вирусов

)5 С 12 й 7/00, С 12 ЕТЕНИЯ проницаемости ител последние ь с внутриклеами и, следоваать влияние на тивируя только ицы. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗО ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научный центр по разработке и внедрению современных методов молекулярнойдиагностики, МГУ им. М,В,Ломоносова иВсесоюзный научно-исследовательский институт гриппа(56) Мацее Й,Е., МШег О.Ч. Кадаге, 1972,ч.235, р.339 - 341,Изобретение относится к медицинской биохимии и касается способа подавления репродукции вируса антителами, специфическими к антигенным детерминантам этого вируса. Способ открывает новые перспективы в медицине, в частности в области создания противовирусной терапии; а также в фундаментальных исследованиях: изучения механизмов вирусной репликации, действия компонентов иммунной системы и т.д.Известен способ для подавления вирусной активности с помощью антител, специфических к антигенным детерминантам вируса. Однако вследствие не клеточных мембран для ант не могут взаимодействоват точными вирусными частиц тельно, не способны оказыв репродукцию вируса, генак внеклеточные вирусные част(57) Использование: медицинская биохимия, Сущность изобретения: в способе подавления репродукции вирусов в качестве противовирусных агентов используют антитела с ковалентно присоединенными к ним остатками жирных кислот. При этом эффективность подавления репродукции вирусов составляет 1,5 - 2 порядка, Выход противо- вирусных агентов составляет 90-1000 от исходных антител, препараты стабильны в течение года. 3 табл. ОДАВЛЕНИЯ РЕПРОД Наиболее близким к предлагаемому по сущности и достигаемому эффекту является способ подавления репродукции вируса с помощью антител путем воздействия на зараженные вирусом клетки антителами, специфическими к антигенным детерминантам этого вируса, включенными в липосомы, поскольку липосомы могут обеспечивать доставку антител внутрь клетки. Культуру клеток М инкубируют с липосомами из сфингомиелина, холестерина и стеариламина, содержащими иммуноглобулины 6(96) с высоким титром к вирусу Коксаки А, и заражают этим вирусом, Через двое суток определяют инфекционную активность образовавшегося вируса, Для клеток, инкубированных с липосомами, наблюдают 23 - 74-ное снижение инфекционной активности по сравнению с клетками, зараженными вирусом, но не инкубированными с липосомами,Недостатками известного способа являются низкая эффективность противовирусного действия, а также сложностьпроцедуры получения липосом, содержащих антитела, и низкая эффективность 5включения антител в липосомы, что приводит к значительным потерям антител приприготовлении противовирусного препарата, Кроме того способ характеризуется низкой стабильностью липосом, затрудняющей 10длительное хранение противовирусногопрепарата,Цель изобретения - повышение противовирусного действия и упрощение способа, 15Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу в качестве противовирусных агентов используют специфические кантигенным детерминантам вируса антитела с ковалентно присоединенными к ним 20остатками жирных кислот,Эффективность способа доказанана примерах подавления репродукциимодельных вирусов. а именно вирусовгриппа различных серотипов и респираторно-синтициального вируса. При действии на зараженные вирусом клеткиантитела, специфичные к антигенным детерминантам этого вируса, с ковалентноприсоединенными к ним остатками жирных 30кислот обеспечиваюг значительное подавление (на 1,5 - 2 порядка, см. табл.1-3) репродукции вируса.В качестве антител можно использоватьиммуноглобулины различных классов и их 35суммарные фракции. В качестве модифицирующих антител реагентов можно использовать различные липиды - производныесинтетических и природных жирных кислот,П р и м е р 1. Получение антител. модифицированных остатками жирных кислот.К 10 нм 0,1 М раствора натриевойсолиди-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты в октане добавляют 450 мкл 1мМ раствора антител в 0,1 М боратном буфере, рН 9,5, Систему интенсивно перемешивают в течение 1 - 2 мин до появленияоптической прозрачности, а затем добавляют к ней 450 мкл 5 мМ раствора хлорангидрида или И-оксисукцинимидного эфира 50жирной кислоты стеариновой или пальмитиновой, или миристиновой и др.) в октане.Через 2 ч белок осаждают из реакционнойсистемы на холоде 0 С) 30 мл ацетона, Выпавший осадок отделяют и промывают 4-5 55раз 30 мл холодного (4 С) ацетона.Остаток ацетона удаляют на роторномиспарителе.Модифицированные антитела фракционируют гидрофобной хроматографией на фенил-сефарозе и определяют выход модифицированного белка, Степень модификации иммуноглобулинов определяют, используя для модификации радиоактивно меченные жирные кислоты,Аффинность антител определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа и методом радиоиммуноанализа.Модифицированные антитела хранят в сухом состоянии при пониженной температуре (-10+11) С),Выход Модифицированных антител по белку составляет 95 - 100 ф , Модифицированные антитела содержат 1 остаток жирной кислоты на молекулу белка. Они сохраняют 80 - 100 специфической активности (аффинности) по сравнению с исходными (немодифицированными) антителами, При хранении в сухом состоянии в течение длительного времени (более года) активность модифицированных антител снижается не более чем на 20 ,П р и м е р 2, Репродукция вируса гриппа (штам Р/Чили, серотип Н 181) в пермиссивных клетках МДСК.Монослой пермиссивных клеток МДСК заражают вирусом гриппа (штамм А/чили, серотип Н 181) со множественностью 1 - 10 бляшкообразующих единиц на 1 клетку, Через 3.5 ч после заражения к клеткам добавля ют антитела (нормал ьн ые кроличьи96; нормальные кроличьи 96, модифицированные остатками жирной кислоты; специфические кроличьи 196 против вируса гриппа серотипа Н 1 М 1; специфические кроличьи 196 против вируса гриппа серотипа Н 1 К 1, модифицированные остатками жирной кислоты) в концентрации, равной их титру в реакции торможения гемагглютинации, Через 8.5 ч после заражения клетки промывают 2 раза 2-кратным объемом среды, в течение 1 ч выдерживают с 2-кратным объемом среды, п ром ы ва ют 5-кратн ы м объемом среды и добавляют к ним свежую среду, не содержащую антител,Через 24 ч после заражения отбирают культуральную среду, осаждают клетки и клеточный дебрис 2-кратным центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. В супернатанте определяют инфекционную активность в эмбриональныхинфекционныхдозах (ЭИДю/мл) и гемагглютинирующую активность в реакции гемагглютинации с 0,7 куриными эритроцитами (ГАЕ/мл),Результаты приведены в табл.1.П р и м е р 3. Репродукция вируса гриппа (штамм А/Техас, серотип НЗМ 2) в пермиссивных клетках МДСК.То же, что в примере 2. но используют ви русы грип па (штамм А/Техас, серотип1730144 Таблица 1 Репродукция вируса гриппа (штамм А/Чили. серотип Н 1 ч 1) в пермиссивных клетках МДСКИнфекционная активность че ее 24 ч. 1 уЯЭИОО/млУсловия эксперимента Гемагглютинирующая активность че ез 24 ч ГАЕ/млЗараженные клетки не инкубируют с антителами Зараженные клеткиинкубируют с:нормальными дб кролика нормальными дб кролика, модифицированными остаткамистеариновой кислоты нормальными дб кролика, модифицированными остаткамипальмитиновой кислоты специфическими дб кролика против вируса гриппа серотинаН 1 ч 1 5.3 8 5.3 5.3 5.3 5.0 НЗК 2) и антитела, специфические к вирусу гриппа серотипа НЗН 2.Результаты приведены в табл,2.П р и м е р 4. Репродукция РС-вируса (штаммаопд) в пермиссивных клетках Неа,Монослой пермиссивных клеток Неа заражают респираторно-синтициальным вирусом (РС-вирусом) (штаммопд) со множественностью 1 - 10 цитопатических единиц (ЦПД 5 о) на 1 клетку, Через 6 ч после заражения к клеткам добавляют антитела (нормальные кроличьи дб; нормальные кроличьи дб, модифицированные остатками жирной кислоты; специфические кроличьи дб против РС-вируса; специфические кроличьи дб против РС-вируса, модифицированные остатками жирной кислоты) в концентрации, равной их титру в реакции связывания комплемента с очищенным вирусом. Через 13 ч после заражения клетки промывают (как описано в примере 2) и добавляют к ним свежую среду. не содержащую антител,Через 28 ч после заражения отбирают культуральную среду, осаждают клетки и клеточный дербис 2-кратным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 25 мин. В супернатанте определяют инфекционную активность по циопатическому действию на культуре клеток Неа (ЦПД 5 о/мл):Результаты приведены в табл,З, Как показано в примерах (табл.1 - 3), подавление репродукции вируса путем воздействия на зараженные вирусом клетки антителами, специфическими к антигенным детерминантам этого вируса, составляет 1,5-2 порядка, в то время, как в известном способе подавление не превышает 1 порядка, Сопоставление данных, приведенных в 5 примерах и известном способе, свидетельствует о том, что подавление репродукции вируса требует по данному способу по крайней мере на 2 порядка меньших концентраций антител,10 При получении противовирусных агентов путем модификации специфических к антигенным детерминантам вируса антител остатками жирных кислот выход модифицированных антител составляет 95 - 100 в то 15 время как в известном способе не более10 О взятых антител удается включить в липосомы, Кроме того, антитела с ковалентно присоединенными к ним остатками жирных кислот можно хранить в сухом состоянии в 20 течение длительного времени (более 1 года)без значительной потери специфической активности, в то время как противовирусные агенты, используемые в известном способе антитела, включенные в липосомы) нельзя 25 хранить более нескольких дней.Формула изобретенияСпособ подавления репродукции вирусов путем воздействия на зараженные вирусом клетки иммобилизованными анти телами, специфическими к антигенным детерминантам этого вируса. о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения противовирусного действия и упрощения способа, используют антитела с ковалентно 35 присоединенными к ним 1 - 2 остаткамижирных кислот.1730144 Продолжение табл. 1 блиц словия экспери Зараженные клетки неруют с антителам Зараженные клетинкубируют с:нормальными 196 кр нормальными 196 крол дифицированными остстеариновой кисл нормальными 196 крол дифицированными остмиристиновой кисл специфическими 196 к против вируса гриппа сНЗК 2 специфическими 196 к против вируса гриппа с НЗМ 2, модифицирован татками стеариновой к специфическими 196 к против вируса гриппа с НЗМ 2, модифицирован татками ми истиновой Таблица 3 епродукция РС - вируса (штамм 1 оп 9) в ример 4 ссивных клетках ловия эксперимента аженные клетки не инкубирс антителамиаженные клетки инкубируюнормальными 196 кроликаными 196 кролика, модифицостатками стеариновой кисческими 196 кролика противруса За нормал ным специфот укция вируса гриппа (штамм А/Техас, серотип НЗИ 2) в пермиссивных клеткаМДСК (пример 3).1730144 10 Продолжение табл. 3 10 15 20 25 30 Составитель С.ПыловаТехред М. Моргентал Корректор Н,Ревская Редактор М.Петрова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 1488 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5