Способ постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации

(51)5 6 01 М 33/53 БРЕТЕНИ ОПИСАНИ овательскии клинической чес методов им 16-217,РЕАКЦИЕМАГГЛЮ медицине, в ения протиелью изобреГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Никитин В. М. Справочни мунологии, Кишинев, 1982, с. (54) СПОСОБ ПОСТАНОВК ТОРМОЖЕНИЯ НЕПРЯМОЙ ТИНАЦИИ(57) Изобретение относится к частности к способам опреде востолбнячного иммунитета. Ц Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения противостолбнячного иммунитета.Целью изобретения является упрощение, сокращение времени и повышение точности титрования столбнячного антитоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации.Поставленная цель достигается благодаря найденной возможности титровать рабочую дозу антигена (очищенный концентрированный столбнячный анатоксин) по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке (ГИСК им. Тарасевича); модифицировать коммерческий антигенный эритроцитарный столбняч-, ный диагностикум путем внесения в жидкую фазу диагностикума очищенного столбнячЫ 1712879 А 2тения является упрощение, сокращение времени и повышение точности титрования столбнячного анатоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации. Для достижения поставленной цели рабочая доза антигена титру- ется по отношению к стандартной йротивостолбнячной сыворотке, антигенный столбнячный эритроцитарный диагностикум модифицируется путем внесения в жидкую фазу диагностикума очищенного, концентрированного столбнячного анатоксина до концентрации, равной предварительно оттитрованной рабочей дозе, реакция проводится при комнатной температуре. 2 табл,ного анатоксина до концентрации, равнойевер предварительно оттитрованной рабочей дозе; проводить реакцию при комнатной температуре.Предлагаемый способ снижает трудо- Я емкость постановки реакции, так как ликви- СО дируется отдельный процесс раскапывания рабочей дозь антигена (она вносится в реакцию в составе антигенного эритроцитарного диагностикума); ускоряет не менее чем на 1 ч получение результатов РТНГА, так как ликвидируется отдельнь 1 й этап контакта испытуемых сывороток с рабочей. дозой анти- гена (в нашей модификации он происходит в присутствии антигенного эритроцитарного диагностикума), что позволяет ставить РТНГА по той же рабочей схеме, что и РН ГА, т.е.действительно параллельно;ликвидируется надобность в антительном эритроци1712879 3тарном диагностикуме для титрования рабочей дозы антигена, так как оно проводится по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке; ликвидируется необходимость в термостате, так как контакт испытуемой сыворотки с рабочейдозой антигена проводится при комнатной температуре; позволяет не только оценить специфичность РНГА по эФфекту ее торможения, но и количественно откорректировать титр определяемых антител в испытуемой сыворотке, так как рабочая доза антигена оттитрована по отношению к стандартной протиаостолбнячной сыворотке к определенному, заранее выбранному количеству Международных единиц (столбнячного анатоксина),Способ осуществляется следующим образом.. П р и м е р. Для осуществления предлагаемого способа проводят титроаание рабочей дозы антигена к 0,1 М Е/мл стандартной протиаоетолбнячной сыворотки (принятая величина "защитного" титра при столбняке), Для этого в микротитраторе Такачи в объеме 0,05 мл готовят серийные разаедения антигена - очищенного концентрированного столбнячного анатоксина (ОСА), начиная с разведения 1:125, на следующем раство.рителе: физиологический раствор (рН=7,2 - 7,25) с добавлением до 1% нейтрального формалина, В каждый ряд серийных разведений ОСА добавляют по 0,05 мл стандартной противостолбнячной сыворотки, первоначально содержащей а 1 мл 0,2; 0,1;0,05; 0,025 МЕ столбнячного анатоксина, Указанные разведения готовят иэ цельной стандартной противостолбнячной сыворотки, содержащей в 1 мл 4 МЕ столбнячного анатоксина. Состав растворителя указан выше. В последствии их подвергают всем манипуляциям, обычным для испытуемых сывороток (инактивация, истощение, разведение 1;10), т.е. в конечном, готовом для постановок виде в 1 мл укаэанных выше разведений стандартной сыворотки, учитывая дополнительное разведение 1:10, будет соответственно содержаться 0,02, 0,01;0,005;. 0,025 МЕ столбнячного анатоксина, Для каждого разведения сыворотки готовят два ряда серийных разведений ОСА-дубль результата. После встряхивания пластины оставляют на 1 ч при комнатной температуре, а затем закапывают коммерческий столбнячный эритроцитарный антигенный диагностикум (СД), встряхивают иммунологический планшет и оставляют при комнатной температуре до оседания зритроцитов (1,5-2 ч), После оседания зритроцитов учитывают результаты титрования рабочей дозы антигена. За рабочее разведение антигена принимается то разведение ОСА, которое способно полностью связать столбнячный анатоксин концентрацией ме нее 0,1 МЕ/мл (в перерасчете на цельнуюсыворотку, не разведенную 1:10) и не способное полностью нейтрализовать сыворотки, содержащие 0,1 МЕ/мл и более, что в первом случае выражается отсутствием агг лютинации СД, а во втором случае в наличииагглютинации СД. Для использованной серии ОСА рабочее разведение равнялось 1:1000.Определив рабочую дозу ОСА, добаа ляем цельный ОСА в коммерческий столбнячный эритроцитарный антигенный диагностикум в количестве, адекватном рабочей дозе, Пример: берут 99,9 мл 0,5% СД, добавляют 0,1 мл цельного ОСА, перемеши вают и после оседания зритроцитов удаляют из надосадка 0,1 мл, Получают 99,9 мл 0,5 0 СД, содержащего в жидкой фазе ОСА в разведении 1:1000 .После этого проводят контроль пра вильности разведения рабочей дозы антигена, В лунки иммунологических планшетов закапывают по 0,05 мл стандартной сыворотки, содержащей 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 МЕ/мл столбнячного анатоксина (истощен ных, инактивированных, разведенных 1:10),на каждое разведение по 3 лунки. Затем во все лунки добавляют по 0,05 мл СД,содержащего ОСА в рабочем разведении. В лунках, содержащих стандартную сыворотку а 35 концентрации 0.,2 и 0,1 М Е/мл (а перерасчете на цельную, не разведенную 1;10),при правильно подобранном разведении ОСА должна быть агглютинация, а в лунках с сывороткой, содеркащей 0,05 и 0,025 МЕ/мл, 40 она должна отсутствовать, После контроляправильности разведения рабочей дозы ОСА такой модифицированный диагностикум (МД) может хранится а бытовом холодильнике и использоваться для.постановки 45 РТНГА длительное время (срок наблюдения6 мес).Постановка РТНГА проводится параллельно с РНГА, В микротитраторе Такачи, в объеме 0,05 мл, делают серийные разаеде ния испытуемых сывороток, подготовленнь 1 х к реакции по обычной для РНГА методике (инактивация, истощение, разведение 1:10). Разведение каждой сыворотки дублируется в других рядах - один для 55 РНГА, второй для РТНГА, В первый ряд(дляРНГА) закапывается СД во второй ряд(для РТНГА) - МД, содержащий кроме сенсибилизированных зритроцитов не фиксированный на эритроцитах ОСА в рабочей дозе.После оседания зритроцитоа (через 1,5-2 ч)производится учет результатов. Реакция сопровождается общепринятыми серологическими контролями (контроль сыворотки,контроль СД и МД),Учет и трактовку результатов проводятна примере испытуемой сыворотки, содержащей 0,8 МЕ/мл столбнячного антитоксина.По сравнению РНГА с испытуемой и состандартной сыворотками устанавливают,что. титр испытуемой сыворотки равен 0,8МЕ/мл. При этом конец реакции в РНГА приопределенной активности СД определяетсяв восьмой лунке. В то же время конец реакции в РТНГА определяетея в четвертой лунке, т.е. она соответствует концентрациианатоксина в цельной сыворотке, равной 0,1МЕ/мл, так как антитоксин в 5, 6, 7 и 8лунках (где он присутствует согласно РНГА)полностью связался рабочей дозой ОСА. Нов испытуемой сыворотке столбнячных антител в 8 раз больше (4 лунка - 0,1 МЕ/мл; 3-я -0,2 МЕ/мл; 2-я - 0,4 МЕ/мл; 1-я - 0,8МЕ/мл), т,е. 0,8 МЕ/мл, Сокращение рядаагглютинации по сравнению с РНГА с 8 до4 лунок говорит в свою очередь о специфичности реакции. Таким образом, результатР Н ГА подтверждается и качественно и количественно.Если при данных условиях конец реакции в РТНГА будет как и в РНГА определяться в 8-й лунке, то торможения непроизошло, т,е. реакция не специфична ирезультат учитывать нельзя,Возможен вариант, когда по РНГА конец реакции в 8-й лунке, а по РТНГА в 1 или2. Следовательно, по РТН ГА титр сывороткизначительно ниже,.чем по РНГА(по РТНГА -0,1-0,2.МЕ/мл, а по РНГА - 0,8 МЕ/мл),т.е.специфические антитела в испытуемой сыворотке присутствуют, но РНГА завысиларезультат и в окончательном варианте титранатоксина в испытуемой сыворотке устанавливается по РТНГА - 0,1 - 0,2 МЕ/мл,Пригодность данного способа базируется на данных, свидетельствующих, чтовведение в состав столбнячного эритроцитарного антигенного диагностикума рабочей дозы антигена (ОСА) никак не- отражается на активности сенсибилизированных эритроцитов, так как при отмыванииот растворенного не связанного антигенаони приобретают первоначальные свойства. Многочисленные (более 100) параллельные с общепринятым способом постановки.РТН.ГА показали, что совмещение этапаконтакта свободного антигена с испытуемой сывороткой и этапа контакта с ней эритроцитарного диагностикума никак невлияет на качество реакции, ее вид не отли 10 нации в РТНГА при использовании термо 15 20 25 30 35 40 45 50 55 чается от общепринятого варианта РТНГА, артефактов не наблюдалось,Параллельным титрованием 83 сыворбток было изучено влияние температурного фактора на ход реакции (см, табл. 1).При этом установлено, что при инкубации сывороток и рабочей дозы антигена в термостате (1 ч при 37 С) торможение идет более полно, т,е. сокращение ряда агглютистата примерно на 2 разведения (2 лунки) больше, чем при комнатной температуре (20-25 ОС), Однако при этом сохраняется очень высокая прямая корреляция результатов обоих. вариантов постановки - коэффициент корреляции - 0,91, что позволяет в предлагаемом способе исключить использование. термостата и проводить реакцию при комнатной температуре,При 387 параллельных исследованиях со 100 сыворотками была проверена повторяемость результатов предлагаемого способа постановки РТНГА. При этом ни в одном случае не было определено расхождений,более чем на одно разведение, что для серологии не считывается существенным,.а в 223 случаях (57,6 + 5,0 О) отмечены полные совпадения результатов реакции, что говорит о практически полной воспроизводимости результатов в предлагаемой модификации постановки РТНГА,В двух опытах было проведено титрование рабочей дозы очищенного концентрированного столбнячного анатоксина по стандартной сыворотке, которое для использованной серии ОСА выявило наличие зависимости между разведением антигена и его нейтрализующей способности, что позволило придать результатам РТНГА свойства, позволяющие определять с еепомощью титр анатоксина в испытуемой сыворотке, т,е, корригировать результат РНГА не только качественно на предмет специфичности, но и количественно, что отличает предлагаемый способ от общепринятой методики,Сводные данные об общих и отличительныхх существенных признаках предлагаемого способа и прототипа приведены в табл. 2.Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед,общепринятым способом: внесение в реакцию .рабочей дозы антигена в составе эритроцитарного диагностикума позволяет ставить РТНГА одноэтапно, что не Менее чем на 1 ч ускоряет учет результатов и дает возможность. учесть реакцию одновременно с РНГА; доза антигена титрования по отношению к стандартной сыворотке позволяет количественно корригировать титры .1712879 Таблица 1 Степень торможения результатов РНГА в РТНГА при использовании термостата и без него при титрований сывороток подей 3лунки 5 6 7 8 Всегонок лунок лунок лунок 2 лункнки 1824 2 лунки 26 33 3 лунк 4 лунк 5 луно луно 7 лунок8 лунокВсего анатоксина по РНГА при возможных ошибках; постановка реакции становится менее трудоемкой, ликвидируется необходимость в дополнительном оборудовании (термостат) и реагентах (антительный диагностикум). Формула изобретения Способ постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации, включающий предварительное определение . рабочей дозы специфического антигена с последующим выявлением соответствующих специфических антител в исследуемой сыворотке после внесения специфического антигена и антигенного эритроцитарного диагностикума по торможению агглютинации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения. сокращения времени и повышения точности титрования столбнячного ана токсина при одновременном проведенииреакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации, рабочую дозу антигенв - очищенного кон.центрированного столбнячного анатоксина 10 определяют при титровании со стандартнойпротивостолбнячной сывороткой, вносят антиген в состав эритроцитарного антигенногодиагностикума и используют на первом этапе постановки реакции торможения не прямой гемагглютинации при комнатнойтемпературе.1712879 10 Таблица 2 Характеристика способа"прототипа и предлагаемого способа постановки реакции торможения непрямой гемагглютинацииСпособ"прототип Предлагаемый способ постановки РТНГАМатериалы и оборудование, необходимые для реакции Эритроцитарный антигенный столбнячныйдиагностикум (коммерческий) .Стандартная противостолбнячнвяГсывороткакоммерческая) Очищенный концентрированный столбнячныйнеадсорбированный жидкий анатоксин(коммерческий)Не нужен Антительный столбнячный эритроцитарныйдиагностикум (коммерческий не выпускается) Термостат Не нужен Титрованив рабочей дозы антигена Постановка РНГД со столбнячным антительным эритроцитарным диагностикумом, рабо, чая доза 2-4 антигенных единицы Схема постановки и условия реакции1"й этап - Контакт рабочей дозы антигена 1-этап " закапывание модифицированного анти" с испытуемой сывороткой (термостат, 1 ч, генного эритроцитарного диагностикума, содер- ЗУОС). жащего в своем составе рабочую дозу антигенаи сенсибилизированные антигеном эритроциты, 2-й этап - закапывание эритроцитарногореагирование свободного антигена с испытуемой антигенного. диагностикума, контакт ссывороткой, а затем несвязавшегося анатоксина испытуемой сывороткой и оседание сенсис аитигенным столбнячным эритроцитарным диагнобилизированных эритроцитов (комнатнаястикумом 1 комнатная температура, 1, "2 ч ,температура, 1,5-2 ч Время Ло учета реакции 2,5"3 ч 15-2 ч Информацияполучаемая в результате реакцииСпецифичность поставовки РНГА Специфичность постановки РНГАТочность определения титра анатоксина виспытуемой сыворотке по РНГА с возможнойего коррекцией по РТНГЯ.Составитель П,БонарцевРедактор В.Трубченко Техред М,Моргентал Корректор О,Кундрик Заказ 533 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Эритроцитарный антигенный столбнячныйдиагностикум (коммерческий)Стандартная противостолбнячная сыроротка коммерческая)Очищенный концентрированный столбнячныйнеадсорбированный жидкий анатоксинГкоммерческий) Постановка РТНГА с серийными разведениямистолбнячного. анатоксина по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке в концентрациях 0,2; О, 1; О, 05; О, 025 ИЕ/мл, ра"бочая доза - разведение анатоксина, способноесвязать полностью столбнячный анатоксин концентрацией менее О,1 ИЕ/мл.