Штамм мyсорlаsма рnеuмоniае 1, используемый для получения диагностикумов и диагностических иммунных сывороток

) ШТАЯ тель ин- риФ и К. дчен сныхтр. Для получения одного штамма Р ез мембранный ф ор 0,22 мкм, Выд ыращивают на пл реде Хейфлика,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИИМ И ОТИЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 1"Проблемы гриппа и вирусных ОРЗЛ 1974, т. 7, с, 132-137,Вег 8 еув шаппппа 1 оГ йегегш 1 пче Ьасгег 1 о 1 о 8 У, 8 ед Ейв Висйшег а 1.Ва 1 гхшоге, 1975,Лисин В,В Демяник И.В., Рако Н,А. в кн.: Иммунология вируи микоплазменных инфекций, Сб,Казахского НИИЭМБ. Алма-Ата, 19136-139. Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в вакцинно-сыворотном дел для получения диагностикумов и специ фических диагностических сывороток.Цель изобретения - создание штамм Мусор 1 авша рпецшопю.ае, обладающего высокой урожайнбстью, антигеноспецифичностью, сниженной вирулентностью. штамма культуру ис -110 пропускают че льтр с диаметром еленные культуры тной питательной тбирают отдельные С 12 И 1/20, А 61 К 39/02,39/40,//С 2 И 1/20, С 12 К 1:35 ИУСОРЬАЯМА РИЕЦМОИТАЕ 1,ДЛЯ ПОЛУЧЕИЯ Я 4 АГНОСТИ ГНОСТИЧЕСКИХ ИКНУННЫХ СЫ ИСПОЛЬЗУЕМЫЙКУМОВ И ДИАВОРОТОК(57) Изобретение относится к мецицской микробиологии и может найти пменение при получении диагностических препаратов Цель изобретения -новый антигенноспецифический, со сниженной вирулентностью., высокоурожайный штамм Мусор 1 авша рпешпопхае,Штамм получен методом клонированияисходного штамма РН, депонированв коллекции микроорганизмов НИИ ЭМим. Н.Ф. Гамалеи под номером 1. ШтаммВ 1 используют для получения антигенов, применяемых для-приготовлениядиагностикумов, для постановки РСКи РИГА, получения иммунных диагностических сывороток, 5 табл. колониивысевают их на жидкие среды. Культуры из отдельных колоний вторично фильтруют, сеют на плотные среды и вторично полученные из отдельных колоний культуры считают клоном. Среди них отбирают такие, которые отличаются слабой выраженностью цилиостатического действия и высокой репродуктивной активностью при росте на поверхности стекла.под слоем жидкой питательной среды.Полученный штамм Мусор 1 авша рпепшопьае депонирован в коллекции культур ВНИИЭМ им, Н,Ф, Гамалеи лаборатория микоплазм и Ь-форм) под 9 1 и ,характеризуется следующими признака1336561Иорфологические признаки.На агаризированной питательнойсреде Хейфлика колонии развиваютсяна 5-й день. Они имеют плотный зер 5нистый центр и прозрачную периферию.Клетки полиморфные в виде слабо ветвящихся нитей, "шаров", "зерен", чтоявляется типичным для культур микоплазмы пневмонии. 1 ОКультуральные и биохимическиесвойства,Растет в аэробных и анаэробныхусловиях, Иетиленовый синий в кон. -центрации 0,001-0,005% и ацетат таллия в концентрации О, 05% рост не ингибирует. Разлагает в аэробных условиях глюкозу, мальтоэу, ксилозу, маннозу до кислоты, не разлагает аргинии и мочевины при росте на питательных средах. Вызывает быстрый бетагемолиз эритроцитов морской свинки,обладает способностью к гемадсорбции.В отсутствии лошадиной сыворотки и. дрожжевого экстракта не растет на 25среде Хейфлика,Антигенная структура.Штамм перекрестно реагирует с антисывороткой к штаммам РН, Р 13 В и780 в реакции ингибиции метаболизмаи реакции нейтралиэации до титра. Меченая иммунная сыворотка в реакцииэпифлюоресценции реагирует со штаммом 1 до тирра, Антисыворотка к штам-,му ГН реагирует с диагностикумами иэ35штамма 1 до титра в реакции связывания комплемента и непрямой гемагглютинации. При обратной постановке реакций, т,е. когда диагностикумы дляРСК и РНГА готовят из штамма РИ ииспользуют для их проверки антисыворотку к штамму 1, они также идут дотитра сыворотки.Использование штамма иллюстрируется следующими примерами. 45П р и м е р 1. Использование штамма Ф 1 для приготовления диагностикума из микоплазмы пневмонии для РСК,Производственный штамм микоплазмы пневмонии, предварительно прошедший контроль на бактериальную стерильность, специфичность, отсутствиепосторонних микоплазм, биологическуюактивность, засевают в литровые матрацы (типа бутыли Новицкого) с 75 млсреды Хейфлика (200 мл бульона изтриптического перевара говяжьегосердца, 20 мл дрожжевого экстракта,50 мл лошадиной сыворотки, глюкозы до 1%, фенолового красного до О, 002%, хлорида натрия до 0,5%, насыщенного спиртового раствора холестерола до 0,1%, пенициллина до 1000 ед/мл, пН 7,8). Инкубируют при 35 ОС, подщелачивая среду до рН 7,8 раствором гидроокиси натрия каждые 6-18 ч, Культуру выращивают 5 дней до образования равномерного слоя микоплазмы ,на стеклянном дне матраца под слоем питательной среды, Стерильным резиновым шпаделем снимают слой микоплазм со дна матраца в жидкую фазу культуры и используют в качестве посевного материала для получения серии антигена, Посевной материал вносят в объеме 6 мл в 300 мл среды Хейфлика,которую затем распределяют по 75-80 мл в литровые матрацы. Посевы выращивают, как описано ранее, После образования достаточного слоя микоплазм на дне матраца питательную среду отсасывают, Слой отмывают от остатков питательной среды 3-кратным споласкиванием буферным изотоническим раствором рН 7,6 и снимают со дна матраца резиновым шпаделем в свежую порцию такого же раствора, Полученный материал контролируют на бактериальную стерильность, содержание микоплазм (по мутности и биологической активности). Он имел мутность 170 ед.П.СК, биологическую активность 10 цКОЕ млзб и был бактериологически стерильным. Клетки микоплазмы пневмонии разрушают ультразвуком при 16 кГц в течение 20 мин. Полученный антиген в разведении 1:10 не обладает антикомп" лементарными и гемолитическими свойствами, при определении антигенной активности методом "шахматного" титрования она составляет 220 ед,Антиген смешивают в соотношении 1:1 с 2%-ным раствором желатина на 20%-ной саха- розе, фасуют в ампулы, лиофильно высушивают и запаивают под вакуумом. Готовый препарат имеет антигенную активность 110 ед в разведении 1:5 не гемолитичен и антикомплементарен, не содержит жизнеспособных микоплазм в объеме 5 мл.П р и м е р 2. Использование штамма Р 1 для приготовления диагностикума из микоплазмы пневмонии для РНГА.Дпя получения серии антигена производственный штамм засевают, выращивают в жидкой питательной среде Хейфлика, получают взвесь отмытых от(коллекция микроорганизмов НИИЗИ им, Н.Ф. Гамалеи), используемый для получения диагностикумов и диагносых микоплазм в объеме 2 мл. тических иммунных сывороток,ТаблицаРеэулътаты перекрестного вэаимодействиа раэличных штаммов мнкоплаэмыпневмонии с антисыворотками к гомо- и Гетерологичным штаммамв различных реакциях Итаммы Титры реакций при постановке их с антисыворотками к штаммам РН 780 13 ВРН 780 13 В РН РН 1 РН Р, нейтралиэации РНГА РСК Р. ннгибиции метаболиэма Р, эпнфлш- оресценцни88 1 6400 3200 6400 400 РН 6400 3200 6400 200 780 6400 3200 6400 400 16 8 16 (4 3200 1280 16 8 16 44 3200 1280 16 8 16 4 П р и л е ч а н и е. - типовой штамм (АТСС 5331)1фф - свелкевыделенный штамм среды клеток, контролируют ее и обрабатывают ультразвуком, как в примере1. Взвесь клеток обладает мутностью190 ед, стандарта ГИСК, биологической активностью 10 д КОЕ мл. Анти-ген в разведении 1:10 не обладаетгемолитическими и антикомплементарными свойствами, антигенная активность его составляет 250 ед. Антиген не содержит жизнеспособных микоплазм (определено посевом 5 мп на50 мл среды Хейфлика). Сенеибилизируют акролеинизированные. эритроцитыантигеном в присутствии бидиазотированного бенэидина и лиофильно высушивают в ампулах в растворе пептона,после чего запаивают под вакуумом.Полученный препарат выявляет в реферес-сыворотке антитела в том же 20титре, что и предшествующие серии(1:2560), специфичен при постановкеконтрольных опытов с сывороткамикрови иммунизированных и интактныхживотных, не содержит жизнеспособныхмикоплазм в объеме 2 мп. Эритроцитыоседают за 1,5-2 ч при постановкереакции с неспецифической сывороткой. П р и м е р 3, Приготовление анти гена из штамма Р 1 для получения диагностических иммунных сывороток.Взвесь отмытых клеток микоплаэмы пневмонии получают с использованием приемов, описанных в примере 1, По лученная взвесь содержит 10КОЕ мл5 а микоплазмы пневмонии и имеет мутность 160 ед. ГИСК, не содержит бактерий в объеме 2 мл, Для инактивации выдерживают взвесь отмытых клеток при -5-10 С в течение 14 дней, после чего вторично контролируют на бактериальнущ, стерильность и наличие жиэ- неспособн Серии, прошедшие соответствующийконтроль, используют для полученияигиунных сывороток. Полученные иммунные сыворотки вызывают появление эо-ны задержки роста 4 12 мм в реакцииингибиции роста микоплазмы, в реакции ингибиции метаболизма 1:32001:12800, в реакции эпифлюоресценции1:8-1:16 и в реакции связывания комплемента 1:1280-1:5120. Для получения длительно хранящегося препаратаантител сыворотки в ампулах лиофильно высушивают и эапаивают под вакуумом.Диагностикуиы и диагностические сыворотки, полученные с использованием штамма 1, стабильны прн хранении при 4 С в течение 2 лет (срок наблюдения).Результаты сравнительного испытания диагностикумов и диагностических сывороток представлены в табл, 1-5.Штамм 1 отличается низкой внрулентностью для человека, Прн инфицировании людей через дыхательные путив массивной дозе вызывает у высокочувствительных людей лишь слабо выраженные кратковременные симптомызаболевания,Штамм обладает высокой репродукционной активностью: через 5 днейкультивирования дает урожай в 300 раэвыше, чем известный штамм, в условияхвыращивания на поверхности матрацапод слоем питательной среды,Формула изобретения1336561 Таблица 2Результаты испытания специфичности иммунныхсывороток, полученных к штамму 1 Серологические Титры реакций при постановке их с антигенами,реакции приготовленными из штаммов: 200 6400 3200 3200 3200 8 8 8 1280 1280 3200 3200 Т а б л и Результаты. сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленных из штаммов 1 и РН, при исследованиисывороток крови лабораторных животных ц а 3 Средняя (Ме) титраи ее доверительныйв реакциях Штаммы Объект исследования Кол-вопроб антителинтервал РНГА РСК Незараженные кроликии хомяки 1РН1РН Зараженные мыши Зараженные и вакцинированные хомяки 1 О (с 5-20) 10 (5-20) 15 15 Вакцинированныекролики 320(160-1280) 320(160-1280) 18 18 таблица 4 Результаты сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленных из штаммов 1 и РН в серологических реакциях (РСК и РНГА) Штамм Время отбора сыворотки крови у волонтеров Средняя (Ме) титра антител и ее доверительный интервал Кол-вопроб РСК РНГА Волонтеры группы 1 РН До инфицирования микоплазмой пневмонии 1 РНс 10(с 10-20)С 10(с 10- 20) 20 (5-20) 20 (10-20) 18 18 После инфицирования микоплазмой пневмонии с 0(с 10-40) с 10(с 0-(10) 40 (20-80) 40 (20-80) 18 18 Волонтеры группы 2До инфицирования микоплазмой пневмонии РН 40 (20-160)40 (20" 160) 19 19 1 РНосле инфицирования микоплазмой пневмонии 160 (80"320) 160 (80-320) 1919 Р.ингибиции метаболизма Р.нейтрализаР.эпифлюоресценции РСКРНГА РН 780 1 ЗВ М.гоминис Н15 (10 ( с 10- с 10) с 5 ( 5-10) 16 10 10-10) с 5 ( 5-10) 35 с 535 (51 О 1336561 Таблица Результаты сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленных из штаммов 1 и ГН, при обследовании парных сывороток людей, больных ОРЗ и острой пневмонией Контингент Кол-во Штамм парныхсывороток Составитель В. ДроздовРедактор Г. Федотов Техред М.Моргентал Корректор С.Черни ВЗаказ 8029 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 РН Дети1РН Взрослые1 124 124 103 103 Число лиц (3)с положительнойсероконверсией