Маркер для люминесцентного иммуноанализа

иБЦ вОЛДВ СОЮЗ СОБЕТО 1 ИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ПРИ ГКНТ СССРОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ лаътню тности к иагностике, в часентов для люмицеслиза, Реагент можекачестве маркераел. Цель изобретеувствтельности лю ентного юиуцоанабьггь использован антигецев и антиия - повышение мицесцецтногоеи ЛКИИН ВС ЦЕНТ НО 2 табл. о порфирины водорастлоримы,точно высокий квантовыйоресценции (до 0,2), рапо длинам волн (более чм) области возбуждения (и излучения (600-640 нм)го, полосы возбуждения ия порфирнов имеют полуши20-25 цм, что позволяет,т д Флунные 80 н нм) 3 х м80 е на420 е т е о ценими ей чувст ор с другг,гц до стгн утт цммуцоан сравнецю метчикаю оль ч счет ука яцесцецтительнос ьцо-л анных вьппе спектных характеристик о ко.ффисо ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ(71) Всесоюзньпнаучно-исследовательский иц ститут биоло гиче ско го приборостроения и Московский институт тонкой химической технологиицм. М,В.Ломоносова(54) 1 АРКЕР ДЛЯ ГО И 1 -МУНОАНАЛИЗА(57 ) Из о бре те ни тся к иммун -Изобретение относится к цммунодиагностике, в частности к химии реагентов для люминесцентного цммуноаналиэа, которые могут быть использованы в качестве маркера антигенов и антител.Одним иэ наиболее чувствительных методов люминесцентного имм;ноанализа является метод с использованием ковалентно связанных с антцтелами или антигенами (цммунологические компоненты) поририновых соединений.В качестве маркеров для люмицесцентного аца; в ,.за -лл .,о;,ценя нов валентцо меченых конъюгатов с ымуцологическими компонентами используют различные типы флуоресцируюших порфиринов, например копрапорфирины ц порц)5 С 01 11 33/532 С 09 В 47/00 муноанализа с временным разрешениес использованием маркерол класса мталлопорфцринов, а также синтез соедпения, которое обладало бп лучлиц люминесцентн;ми свойствамц по сравнениюс .звестньми маркерами. Поставленнаяза,ача рсшаетсл синтезом соединенияРг- копропорфирина 111 тетракислоты.Данное соединение примерно в 5 разпревосходит по уровню люмццесценцииРЙ-копропорфирин 1 и обеспечивает более высокую чувствительность люмццесцентцой детекции меченых соедц еций.,с заместителями по мезополож1 3 - 1707539 циента экстинкции =150 .000-200.000) в полосе Соре (380-420 нм),Безметальные порфирины имеют время лзатухания лкиинесценции в водных растворах при комнатной температуре порядка 1-10 ф 10 с.В твердофазном иммуиоанализе чувствительность определения иммунологических компонентов с помощью этих меток 10 ограничивается уровнем 10-1 ОН и обусловлена тем, что эквивалентный уровень фонового сигнала дают примеси, рассеяный свет и собственно полисти 1- Рольный планшет, в котором проводятся 15 эти измерения.Наиболее близким аналогом предлагаемого маркера для люминесцентного - . . иммуноанализа является РЙ-копропорфирин, Этот реагент, по сравнению с безметальными порфиринами, способен длительно люминесцировать-Фосфоресцировать при комнатной температуре в водном растворе.Для этого соединения характерно: 25 максимум возбуждения - 392 нм, максимум люминесценции (фосфоресценции) - 665 нм, в полосе возбуждения в водном растворе 6 188 400, полуширнна в поло" сах возбуждения и Фосфоресценции 25 нм, время жизни Фосфоресценции в водном растворе с сульфитом натрия (2 мгlмл) и 0,1 Х тритона Х1,2 к 10 с. Для Рй-копропорфйрина время задержки мезду актом возбуждения люминесценции и началом регистрации Фосфоресценции составляет 0,210 (время, эквивалент- ное времени затухания фосфоресценции), 1По сравнению с другими описанными в литературе металлопорфиринами, таки. ми как Еп-, А 1-, Яп-, Рд-комплексы, предлагаемыл более чем в 16 раз превосходит их по уровню интенсивности люминесценции. Тем не менее, достигнутый пределдетекцни с помощью РЙ-комплексовуступает хелатам с ионами Еотипа-дикет онов,Целью изобретения является повьцпение чувствительности люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением с использованием маркеров класса ме-. талюопорфирлнов, а также синтезсоед 1- нения которое обладало бы лучшими люминесцентными свойствами по сравнению с известными маркерами.35Конъюгаты с иммунологическими компонентами для РЙ-комплексов порфиринов получают путем их,актнвалии с использованием карбодиимидов и последующего связывания с аминогруппами иммунологических компонентов. Существование длительной люминесценции Рй-копропорфирина со временем затухания 1,2 10 с позволяет использовать его в иммуиолюминесцентном анализе с временным разрешением (ИЛАВР) и повысить чувствительность определения иммунологических компонентов до 10 ф М. 50 Поставленная задача решается синтезом по схеме соединения РС-копропорфирина 111 тетракислоты.Б СООСН 55 ОСН Повышение чувствительности в ИЛАВ постигается за счет резкого снижения фона примесей и исключения вдтияния рассеянного света. Технически это обеспечивается тем, что процесс регистрации люминесценции ведут раздел но во времени от акта воэбужрения. СНСН(СООС протек Соединение (3) по тучаит реакцией30 тетраметилового эфира копропорфирина с солью двухвалецтной платины в бензонитриле, а затем омылением платинового комплекса тетраметилового эфира действием 2 И едкого кали в тетрагидрофуране до платинового комплекса тетра 35 кислоты копр.)порфирица.Соединение (3) представляет собой игольчатые кристаллы (из хлороформа и метанола) оранжевого цвета, т.пл.191-192 С, и характеризуется следуюцими спектральными данными.ИК-спектр (СНС 1), Р, си ; 1720,7 (СО,-СН,).Электро спектр, (СНС 1), , Ех 10 Зим: (285); 501,5 (12,8 561,1 (50).Ф Элементн став.Найдено, 53,14; Н 4,93;6,19.С 401144 Н 4081П р и и е р 1. платиновый кометраметилового эбира копроа 111.20 мг порфир:ша (1)0 мл бецзоц :1)ц.па. об)а1,1 моль) хлороплатццитК РСС.4 1) и кипятят содпльнцко, Контроль за а реакции ведется спектрофотометрическг,. Через 8 ч добавляют еге 80 мт (055 моль) соли и продолжают цагревание до тех пор, пока п спектре цс исчезнут полосы, характерные для с бодного основания порбприца. При том отнощецие полос с составляет 3-3,." ,Бензонитрил отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в хлороФорме и хроиатографируют ца силикагеле 40/100 И в системе хлороформ-мета- . нол (2:1). Отбирают Фракцию оранхевого цвета, содержащую платиновый комплекс (11) . Дополнительную очистку проводят с поиогью препаративной тонкослойноц хроиатографиц ца окиси алюминия 1" ,степени активности в хлороЛорие. Отделяют наиболее подвижную зону платинового комплекса, вецество элюируют с окиси алюьацщя смесью хлороформ-эЛир (5:2). Растворцтели упаривают досуха. Ппатиновый комплекс перекристаллизовывают из смеси хлороФорм-метанол, получая 174 иг (577), т.пл. 191-19 С.Эпектроццый спектр (1) ц, .)81 3 ( 8) ) 12 8) 536,1 (50).ИК-спектр, (СН Ь, с1П 1 Р-спектр (СПС 1-), б;9,67 (с, Н); 9,65 (с, Н); 1707539 89,68 (с, Н); ти 650-800 ни, соотогение уровня с.ан 9,63 (с. Н дартиого сигдлд для т 600; 700(904 758),Найдено, 7: С 53,52; Н 5,04;С 4 оПо.Н,О 8.Вьтислено, Х: С 53,14; Н 4,93;И 6,19.П р и и е р . Платиновый комплекстетракислоты копропорФиринд 111 (111) .20170 иг платинового комплекса тетраметилового эЬира копропоририна 111(11) суспендируют в 15 ил тетрагидрофурана добавляют 15 ил .". И едкого каВ15лия и кипятят с обратным холодильником н течение 3 ч. ТетрагидроЬуранупаринают и вакууме, останкися раствор разбавляют в 10 раз водой, Фильтруют, подкисляют 107.-но соляной кислотой до рЛ 4,0, Вьпанэий темно-красный осадок (111) отФильтроньндют,промывают водой и суэат в эксикаторе-максимум люминесценции (Ьосборесценции) 645 ни, полуирна максимума возбуждения 20 ни, полуирина максимума6 осЬоресценции 2 1 ни, квантоньп выходлюминесценции 0,6-0,7. Времязатухания лктпнесценции (н е раз) 0,075 т10 с.Условия регистрации: водый раствор с 2 нгlмл сульЬта и 0,1 Е-ьптритон Х, рН 7,4, 50В табл. 1 представлены данье сравнительной сценки люинесцентыхсвостн коъюгатоу антител с рдэличтн пьеткдп (10 1), йдлз проведенспек гроЬлуориот ре етрет тен нлс ра з-;5Ретзением модели,8-5 В рь Регипт. т"телег беэ коррер на чувствительттсть ио длинаи г;оли. тутзствттельностьуоретра заметно снижается и облдси 800 ни соотнетстнеиио: 1; 0,4 и О 1 оти. ед.Иэ данных табл,видно, что конъюгат белка с предлагаемым реагеитом почти в 5 раз превосходят по уровню люпнесцец конъюгаты с РЙ-копропорРирон и близки к уровню люиинесценщш ионов Е в усилнаюе растворе+брил 1.КВ Иаас.В табл.предстанлен сравнительные данные по чувствительности метода ИЛЛЗР с предлагаемыми метками на отечественном Ллуоретре с нреиенныи разренеием (ВНИИ БП).Условия регстрани для РЙ-копро- порЛрина и Е оптимизированы, а3- для Рс-копропорбрна такой оптимизации ие проведено из- за конструктивных особеосте прибора - ограничение нреиеии задержки стробд уровнем 0,12510 с и времени регистрации 0,510 с. Пля Рг.-копропорЬириа оптиидльныии янляттттся условия М (С за-, держки)=41,05 1 О"с, С, (г. регистрации)=0,10 с.1 Из данных табл. 2 видо, что предлагаеа." редгент детектируется на уровне реагента,ирмы 1,КВ д 11 ас с чувствтельостьи не менее 101,Кроме того, учитиндя всокий козбЬициент светииости (произведение квантового выхода на Й(ЕС 1) н полосе по - глогения) предлагаеттго реагентд нд уровне (284 10 х 0,6)=170,400, который превосходит козЬпиет сиетимости для ионов Ет+ - соответственно (30,000 х 0,7)=2 1,000 и Р 1-копропортЬирина (84,000 х 0,2)=36,000.Такии образом, Рг. - коропорЬир 111 тетрдкслота облдддет лучми люминесценть снойстнаии как маркер для лопесцентного анализа.По сравнению с маркерами на осно+ве ионов Ец предлагаемп идми редгент позволяет упростить иииуноанализ эа счет исключения стадии, связанной с переводом ионов Е. н люиинеСцируюций коиплекс, так ндэываемьг усиливаюзш раствор.Геаг;тттдйлет преее т;туоднатзе и качестве тттттттс т.центного ларкера аитигенов и антител, которые входят составной частью в диагностические тест-систем дляунных аалиэон.10 1707539 как маркер для люиинесцснтного иммуноанализа. Фориула изобретенияРС-копропорФирин П 1 тетракислатаформулы СООН(ЬКВ Ыа 11 а Интенси ность отн. е 1120 2 0 мальозно не 40 3 38 615 645 0 блица 2 интенсивность люна при несценции, е ВНИИ БП с н цент рация РС-копропорЬирип 11тки в пробе, М И=0,125 10 ссд=0,5 10с Рс-копропорфирин 1ей=0,25 10 фссд=2" 1(Г с е 0 М о-ф 0 н 20080 (80 9,0 (9 1,9 (1 1,0. Фон раств О,Перегрузка показаний приборапревышающем разрепение приборчиваются 100,000-280,000 (в ск дюну). ри количестве импульсна цифровом индикатобках указано отношен чм Максималное излучение,нмВремязатухания