Способ определения -субъединицы фактора роста нервов

(И) 51)5 С 01 Ю 33/534 ТЕЕННЫЙ НОМИТ РВЕНИЯМ И ОТКР СССР УДАРСИЗО ЕТ АВТОРСКОМУ С 8.21 ес 1.:286-306,ЪЕ,71 НИЦ 11 анализуожет быть, гого опреа ростаале. Целмлении-субьеинд ьгн пч пляется повышепособа.ся следующим обЧерезцин отученил ионо Зап 1 и на но 1 г нропо- пм ИСАЯЙЕ ИЗС(71) Институт Физиологии ЛН(57) Изобретение относится кбиологических иатериалов и миспользопано для количественделения 1 з-субъединнцы факторнедвов в биологическом материзобретения заключается в почувствительности определения Изобретение относится к анализу биологических материалов и может быть использовано для количественного определения Д-субъедьшшр. с 5 актора роста нервов ф-ФРН) и биологическом материалеЦелью изобретения яние чувствительности сСпособ осуцестпляетразом,Иммуноген - коиплексную орму ФРН получают из подчелюстньг. слюнних пелез полово"релых беспородньгс самцов гг.;,гей с использораннеи методов гель-) льт )а 1 н и,ф;,; ;-арфе нфе "в чог,ао;ггии. Полученная коин:1 екеная эорма ФЕН представляет собой белок с молекулярной иассой 140 кД, состоягрщ нз двух рс-,в , и одной -субъединицы, несу. гединицы актора роста нервов (-ФРИ). Суцность изобретения состоит в тои что определение проводят радиоиимунологическим спасибои, при этом животных иммунизируит комплексной Формой ФРН, очистку образовапрпсхся антител проводят на аФинном носителе с ковалентно связанной -ФРН при помощи элюции раствором, содерлацим О," 0,5 И БаС 1, рП "., 3, Радиоактипную метку з 1 и игтитела вводят с поиоцью иодоге 11 а в виде твердой азы, на которую сорбируют намеченные антитела, используют полистирол. По срапнению с прототипом способ позволяет повысить чувстзительность определения -ФРН с, 1 до О, 1 нг,ил. 1 табл.Ф щей биологическую активность. Лнтитела получают путем пролонгированнойиммунизации новозеландских кроликоввыделенной коиплексной Формой ФРИ сдобавлениеи полного адъюванта .п,5-3 месяца от начала иммуниза,гбирают у кроликов кровь длл полантисыворотки.Р-субъединицу ФРН для проведенияанниной хроматографии пьгпеляютобменной хроматограней. Ииио билполученной субъедншцир оп опятснтеле СИВг-актипиропанной сеФарозе4 В ("Р 2 гагпасза" Ипецил), ОтмывкуСКВг-активнропанггой сегпрочг 1 48дят 200 гсл 10 З 21 С 1 на стектяняФильтре. Через СИВг-активированную сеЬароэу 4 В быстро (30 с) пропускают 30 ил охлажденного бикарбонатного буфера (раствор 0,2 И ИаСО, содержаций 5 0,2 И ИаС рН 8,5); суспендируют ее с 5 иг -ФРН, находящегося в 15 ил этого же охлажденного буфера, и перемешивают с поиоцью встряхивателя.("Ргешес 1" ПНР) в течение 2 ч. Избы 10 ток -ФРН удаляют центриЬугированием с последуюцей промывкой бикарбоиатным буфером, оставшиеся активные группы инактивируют обработкой 0,1 М трисНС 1 рН 8,0 в течение 2 ч при встря хивании. Далее отмывают -УРН-сефдрозу 4 В следуюциии раствораии: 0,05 М трис-НС 1 рН 8,0, 1 И ИаС 1 (20 О ил);0,05 И трис-НС 1 рН 8,0; 1 И ИаС 10,4 Х-ный холат натрия ("Вегта" ФРГ) 20 (200 мл)р 0,05 И трис-НГ 1 рН 8,01 0,2 И ИаС 1 (2 ОО мл); 0,5 И ИаГ 1 в 0,01 И НС 1 рН 2,3 (2 ОО мл); 0,05 И трис-НС 1 РН 8,0; 0,2 И ИаС 1 (20 О мл).Инкубацию 5 ил антисиворотки к комплексной Форме ФРН с -ФРН-сефароэой 4 В проводят в пробирке в течение 3 ч при комнатной температуре, перемешивая. Далее носитель отиыва:,: от не- специфически сорбированных белков до 30 тех пор, пока оптическая плотность (Дл 8 о ) супернатанта не становится ниже 0,05. Содержимое пробирки переносят на стеклянный фильтр и промывают следуюцими раствораии: О,О 5 И .35 трис-НС 1 рН 8,О; 1 И ИаС 1 (5 ОО ил);0,05 И трис-НС 1 рН 8,О;И ИаС 1, 0,4 Х-ный холат натрия (ЗОО мл);0,05 И ацетатный буфер рН 5,О(300 ил); 0,05 И трис-НС 1 рН 7,5; 40 0,2 И ИаС 1 (ЗОО ил); бидистиллированная вода (200 мл). Суспензию помецают В цейтриФужную пробирку и центриФугируют (ЗООО обмин) на ИРЧ(ПНР) в течение 3 иин. 45 Элюцию молекул антител, адсорбированных на иммобилизованнои лигднде проводят, используя раствор О,О 1 М НС 1 рН 2,3, содержаций О,2-0,5 И ИаС 1. 50 К осадку добавляют 5 ил охлахренного раствора элюируюцего буфера. Содеряя-, иое пробирки встряхивают на холоде в течение 15-2 О мин. Су .пензию центрифугируют (ЗО нО оо иин, 3 мин). Оие - рацию получения элюата повторяют дважды. Затеи концентрируют антитела к -ФРН (АТ 3-ФРН), нейтрализуют 1 И ИаОН до рН 7,О и лиофилизируют. Аффинный сорбент регенерируют О,2 МИаС 1 в О,О 5 И трис-НС 1 буфере, рН 8,0.Введение радиоактивной метки в аффинно очигенные антитела осуцествляютследуюцим образом:мг иодогена(1,3,4,6-тетрахлоро-ЗК,60-дифенил глуколурил) ("Регсе" СГА) растворяютв 10 мл перегнанного хлороформа. Изполученного раствора отбирают аликвоту 1,6 мл, которуо доводят до 10 млперегнанным хлороформом и перемешивают. В пробирку для радиоиодированиявносят 4 икг иодогена в 25 О мкл и удаляют растворитель под небольции током инертного газа. Полученные пробирки хранят в морозильнике при -16 С3 течение 2-3 месяцев.В пробирку с 4 мкг иодогенд последовательно вносят 5 О мкл Иа 1 в0,2 И трис-НС 1 буФере рН 6,4 и 9 О мкгАТ,рщ, доводят инкубационную смесьдо 250 икл вышеуказанным буфернымраствором. Инкубируют при комнатнойтемпературе 1 О иин; Для отделения1 1-АТл от продуктов рддиоиоди - ррнроваиия реакционную смесь хроматографируют на колонке (0,9 х 60 см) с сефакрилои 3-200 ("РЬагшасда" Лвеция)или Тоурег 1 Н 7-60 зцрегГьпе ("Тоуозода" Япония), уравновешенной в О,О 5 Ифосфатном буФере рН 7,4, содержацем0,17-ный бычий сывороточньпЧ альбумин.Элюдт собирают по 0,5-0,7 ил в пробирки содержацие 0,5 ил раствора 17,-ного бычьего сивороточного альбуиинав О,О 5 И Фосфатном буфере рН 7,4.Удельная радиоактивность .1 -АТр,1,Р составляет 4-6 икКи/мкг. ТХУосаждаемая радиоактивность в среднемнаходится в пределах 88-95 Х.В качестве сорбеитд антител (афонино очиценньгх АТр) используют полистирол, наприиер, в виде планшета("Р 1 ост" Великобритания),Смеривание антител и антигенов припроведении иимунохимической реакциипроизводят следуюцим обрдэои. Покрывают лунки полистироловых пЛаншетов2 мкг ЛТр.р в 2 ОО мкл 0,1 И трис-НС 1буфера рН 7,5 и инкубируют в термостате в течение 2 ч при 37 С; блокиоруют остаточные белок-связывавшие участки полистнролд (трижды прогибая лу ки) О,О 5 И Фосфатныи б;ерем раствором рН 7,4, содерждцим 17-ный бычийсывороточный дльбуиин, О,5 И ИаС 10,057. азид натрия ("Бегча" ФРГ) (буФер для андлиза); инкубируют (17 ч,