Способ определения биологической активности сульфаниламидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ТЕНИЯ едовател оиЛ,М.К са апо 16, 4, р ится к медицине, повышение точно ст ГОСУДАРСТВЕНЮЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ленинградский научно-исслский институт детских инфекций(56) авагас М. ет а. СЬерЬагаасоо 9 са Воети. 1968,721-727. 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СУЛЬФАНИЛАМИОВ Изобретение отноименно, к фармакологи Цель изобретения и и определения. пособ осуществляют следующим обр Выясняют тип ацетилирования у обследуемой группы кроликов с помощью нагрузки сульфадимезином, Готовят раствор сульфадимезина 0,5 г и в 100 мл дистиллированной воды (0,018 М раствор). Взвешивают 500 мг сульфадимезина переносят в колбу на 100 мл, добавляют небольшое количество дистиллированной воды, перемешивают, для полной растворимости добавляют по каплям 1,0 н. и 0,1 н. раствор щелочи МаОН и после растворения сульфадимезина раствор нейтрализуют до рН 7,0- 7,5 1,0 н. и 0,1 н. раствором соляной кислоты. Объем доводят до 100 мл дистиллированной водой,51.1 1704152 А 1(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, Цель - повышение точности определения. С этой целью после введения исследуемого препарата экспериментальному животному осуществляют забор 0,075-0,15 мл крови, выявляют медленный и быстрый ацетилярный прототип и при превышении концентрации препарата у медленных ацетиляторов по сравнению с быстрыми на 23 и более определяют биологическую активность сульфаниламида. Применение способа позволяет повысить точность определения биологической активности сульфатиламидов на 30 по сравнению с прототипом,Перед обследованием кролика взвешивают, Раствор сульфадимезина 0,50 г/100 мл вводят внутрибрюшинно с учетом веса животного 20 мг на 1 кг (4 мл раствора). Через 1 ч после введения сульфадимезина берут кровь иэ ушной краевой вены уха в количестве нескольких капель (0.075-0,15 мл) на фильтровальную бумагу е квадрат размером 25 х 25 мм. Кровь должна и роп итывать фильтровальную бумагу. После этого кровь высушивают на воздухе при комнатной температуре, Непосредственно перед определением вырезают квадрат 25 х 25 мм, содержащий высушенную пробу, Измельчают его ножницами, помещают в центрифужную пробирку, добавляют 0,5 мл 20;-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Проба стоит 15-20 мин, в течение которых ее несколько раэ перемешивают для полного извлечениясульфадимезина в раствор. Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при 3000 об,/мин, Полученный центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки с размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. К 0,5 мл центрифугата в каждую из двух пробирок прибавляют по 0,1 мл 4 н.соляной кислоты, перемешивают встряхиванием. Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгоЯ и ставят гидролиэоваться на 45 мин и кипящую водяную баню (1000 С).В гидролизованной пробе определяют общиЯ сульфадимизин, т.е. ацетилированный и свободный вместе, а в пробе, которую не подвергают гидролизу - свободный сульфадимезин. Далее обе пробы гидролизованную и негидролизованную ставят в холодильник при 4 С на ЗО мин. Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробирки приливают по 0,1 мл 0,2,6-ного азотистокислого натрия (раствор должен быть свежеприготовленным, т.е. готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике), Пробы перемешивают встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0- ного раствора аммония сульфаминовокислого, встряхивают. Через 2 мин приливают 0,2 мл 0,01-ного раствора Й-(1)-нафтилэтиле ндиаминдигидрохлорида. Пробы помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Наблюдают розовое окрашивание раствора, оптическую плотность которого определяют на микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно "холостого" опыта, который ставят параллельно гидролизованной и негидролиэованной пробам. но в котором экстрагировали измельченный квадрат чистой фильтровальной бумаги размером 25 х 25 см. Количество сульфадимезина определяют по калибровочной кривой (мкмоль).В гидролизованной пробе определяют количество общего сульфадимезина (ацетилированный сульфадимезин плюс свободный сульфадимезин), В негидролизованной пробе определяют только свободный неацетилированный сульфадимезин. Количество 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ду общим сульфадимезином и свободным. Активность ацетилирования выражают процентным отношением ацетилированного сульфадимезина к общему его количеству.Если определенный процент ацетилирования ниже 50, то обследуемый кролик с медленным типом ацетилирования, если выше 50 то с быстрым типом ацетилирования. Таким образом отбирают группу животных, включающую медленных и быстрых ацетон;лированного находят по разнице меж-, 50 ацетиляторов для определения биологической активности исследуемого препарата.Сульфадимезин, применяемый для фенотипирования, у отобранной группы кроликов с медленным и быстрым типом ацетилирования удаляется иэ организма в течение 1-2 сут и по истечении этого срока кроликов пользуют для определения биологической активности исследуемого препарата.ИспытуемыЯ сульфаниламидный препон рат в дозе, эквимолярной сульфадимезину, т,е. 0,072 ммоль нв 1 кг, вводят внутрибрюшинно и через 1 ч берут кровь из ушной краевоЯ вены в сухую центрифужную пробирку. Кровь центрифугируют при 3000 об./мин 100 мин, В сыворотке определяют концентрацию свободной активной формы испытуемого препарата. 8 центрифужную пробирку, содержащую 0,5 мл 20-ного ТХУ, добавляют 0,1 мл сыворотки и 1,4 мл дистиллированной воды до объема 2,0 мл. Через 5 мин пробу центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Полученный центрифугат используют для определения концентраций активной свободной формы препарата. Для этого к 0,5 мл центрифугата приливают 0,1 мл 4 н.НО, После охлаждения в холодильнике к пробе добавляют 0,1 мл 0,2-ного йай 02 (свежеприготовленного), пробу встряхивают и через 4 мин добавляют 0,1 мл 1,0-ного аммония сульфаминовокислого, снова перемешивают встряхиванием. Через 2 мин в пробы приливают 0,2 мл 0,01-ного Йнафтилэтилендиаминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч, в течение которого через каждые 15 мин ее встряхивают для удаления пузырьков газа, Оптическую плотность раствора измеряют при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см против "холостого" опыта, постановка которого аналогична и параллельна пробе, но вместо исследуемого материала, т.е, и вместо 0,1 мл сыворотки, добавляют 0,1 мл дистиллированной воды.Концентрацию (в мкмоль/л) исследуемого сульфаниламидного препарата в его активной свободной форме находят по калибровочной кривой, построенной для данного препарата, Вычисляют среднюю величину концентрации свободной формы и ее среднюю ошибку, отдельно в обследуемой группе с медленным ацетиляторным фенотипом и отдельно -с быстрым ацетиляторным фенотипом. Вычисляют достоверность различия средних величин концентраций активной формы сульфаниламида в сыворотке соответственно у медленных и быстрыхацетиляторов,В случае если концентрация препарата превышает у медленных ацетиляторов соответствующий показатель у быстрых ацетиляторов на 23 и более определяют биологическую активность исследуемого препарата.П р и м е р 1. 20 взрослым беспородным кроликам вводили раствор сульфадимезина 0,50 г/100 мл внутрибрюшинно с учетом веса животных 0,072 ммоль на 1 кг. Через 1 ч порле введения сульфадимезина берут кровь иэ ушной краевой вены уха в количестве нескольких капель на фильтровальную бумагу в квадрат размером 25 х 25 мм в объеме 0,015 мл. После этого кровь на бумажках высушивают на воздухе при комнатной температуре.Перед употреблением вырезают квадрат 25 х 25 мм, содержащий высушенную пробу и измельчают его ножницами. помещают в центрифужную пробирку. К пробе добавляют 0,5 мл 20-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. Пробы стоят 15-20 мин, ее несколько раз перемешивают, Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при 3000 об./мин, Центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки размером внутреннего диаметра 1 О мм и высотой 120 мм, К 0,5 мл центрифугатв в каждую из двух пробирок прибавляют по 0.1 мл 4 н.НС, перемешивают встряхиванием, Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидролизоваться на 45 мин в кипящую водяную баню (100 С). В гидролизоеаннсй пробе определяют общий сульфадимезин, т,е. ацетилирсеанный и свободный вместе, а е пробе, которую не подвер"ают гидрслиэу - свободный сульфадимезин. Далее обе пробы гидролизованную и негидрслиэсеанную, ставят в холодильник при 4 С на 30 мин. Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробы приливают по 0,1 мл 0,2 -ного дзстистокислого натрия Мдй 02 (раствор МаМО 2 должен быть свежепригстоеленным т.е, готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике). Пробы перемешивают встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0-нсгс раствора аммония сульфаминовокислсгс, встряхивают. Через 2 мин приливают 0,2 мл 0,010 -ного раствора Й (1)-нафтилэтилендиами ндигидрсхлорида. Пробы помещают е темноту на 1 ч через каждые 25 мин встряхивают для удаления пузырьков газа.Оптическую плотность исследуемого раствора определяют на приборе микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно"холостого" опыта, который ставят параллельно гидролизоеаннсй и негидролиэованной прсбач, нс ь кс срсм экстрагирсвали измельченный квадрат чистой фильтроеальной бумаги размером 25 х 25 мм. Расчет количества сульфадимезина (мкмоль) в пробе ведут по калибровочной кривой, Определяют количество общего сульфадимезина в гидролиэованной пробе и количество свободного сульфадимезина в негидролизованной пробе. По разнице между общим и свободным сульфадимезином находят ацетилированный сульфадимезин. Активность ацетилирования вычисляют по процентному отношению ацетилированного сульфадимезина к общему.В результате проведенного исследования у каждого из 20 кроликов по полученному проценту ацетилирования устанавливают ацетилятсрный фенотип. Если определенный процент ацетилирсеанияниже 50%, то обследуемый кролик с медленным типом ацетилирования, если выше506, то с быстрым Млпом ацетилироеания,ков в результате фенотипирования было выявлено 15 кроликов с быстрым типом ацетилирования, у которых средний процент ацетилироеания составлял 71,7 1,2 и 5 - с медленным типом ацетилирсеания, где процент ацетилирования в среднем равнялся 32,9+4,7.Из тестируемой группы далее отбирают 5 кроликов с медленныл; и 5 кролик" в с быстрым т псм ацетиирсеания и через 1-2 дн вводят внутрибрсшиннс(натощак) испытуемый препарат норсульфазол е той же эквимслярной дозе - 0,072 ммсль на 1 кг массы тела, Через 1 ч берут крсеь 0,5-1 лл иэ краевой ушной еены е центрифужнугэ пробирку. После цен; фугирсеания е сыесрстке определяют т=,".ко кснцентр. - цию дктиенсгс неиэмечнсс прпдзя ДРя этого к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,5 мл 20- ного раствора трихлс., ксуснсй кислоты для осаждения белков и ,4 ;л "лоти,-,л рсванной есды, Общий объем 2 О мл, Тщательно перемешивают содам: имое прсбис.л и проба стоит 15-20 лин. Далее пробу .= рифугируют при 3600 сб,/мин. Отбирают 0,5 мл центрифуггта е пробирку с раз ессм внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм, Прибавляют к центрдфугату 0,1 мл 4 н.НС, перемешивают встряхиеани:м, Помещают пробу е холодильник 4 С на 30 мин. Сразу после охлаждения приливают 0.1 мл 0,2%-ного аэстистскислсго натрия МаМО 2 (сеежепригстселеннсгс После каждого добавления реактивов ссдерхимсе пробироктщательно перемешивают встряхиванием, Через 4 мин 0,1 мл 1,0-ного раствора аммония сульфаминовокислого, через 2 мин - 0,2 мл 0,016-ного раствора й-(1)-нафтилзтилендиаминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа, Оптическую плотность измеряют на приборе микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно "холостого" опыта, который ставят параллельно с пробой, добавляя вместо сыворотки 0,1 мл дистиллированной воды, Расчет концентрации активной свободной формы норсульфазола ведут по калибровочной кривой. построенной для данного препарата.В результате были получены следующие значения концентраций для свободной формы норсульфазола у 5 медленных кроликов, мкмоль/л: 253, 234, 300, 157, 253, что в среднем составляет 239+28, а у животных с быстрым типом ацетилирования: 110, 120, 68, 131, 151, в среднем 117+7. Далее оценивают различия по критерию Стъюдента, При данном количестве случаев р0,01 (т.,е. меньше 0,05),Таким образом, при одинаковой дозировке норсульфазола концентрация его активной свободной формы будет выше у медленных ацетиляторов, в данном случае 239 мкмольл, чем у быстрых ацетиляторов 117 мкмоль/л на 104, т.е, определена биологическая активность препарата.Для подтверждения повышения точности предлагаемого способа по сравнению с известным была определена концентрация активной формы препарата норсульфазола у этих же 20 беспородных кроликов без предварительного фелотип:рсвания. Б среднем концентрация норсульфазола составляла 142 +16 мкмоль,л.Таким образом, среднее значение к" нцентрации свободной активной формы препарата по известному способу 142 16 мкмоль/л на самом деле складывается из значительно более высокой концентрации испытуемого препарата у медленных ацетиляторов 299+28 мкмоль/л, т,е. точность при сравнении с известным способом для медленных ацетиляторов повысилась на 68. и более низкой концентрация у быстрых ацетиляторов 117.17 мкмоль/л,П р и м е р 2. 20 взрослым беспородным кроликам вводили раствор сульфадимезича 0,50 г 100 мл внутрибрюшинно с учетом веса животных 0,072 ммоль на 1 кг. Через 1 ч после введения сульфадимезина берут кровь из ушной краевой вены уха в количе 5 10 15 20 25 30 35 45 50 55 стве нескольких капель(0,15 мл) на фильтровэльную бумагу в квадрат разл;ером "5 х 25 мм. После этого кровь на 6 ма ках высушивают на воздухе при комнатнсй температуре.Перед употреблением выреза,от квадрат 25 х 25 мм, содержащий высушенную пробу и измельчают его ножницами, помещают в центрифужную пробирку. К пробе добавляют 0,5 мл 20 о -ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 1,5 мл дистиллированной воды, Проба стоит 15-20 мин, ее несколько раэ перемешивают. Далее пробу центрифугируют 20-30 мин при 3000 об./мин, Центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки размером внутреннего диаметра 1 О мм и высотой 120 мм. К 0,5 мл центрифугата в каждую из двух пробирок прибавляют по 0,1 мл 4 н,НС 1, перемешивают встряхиванием, Одну из двух пробирок плотно закрывают фольгой и ставят гидролизоваться на 45 мин в кипящую водяную баню(100 С), В гидролиэованной пробе определяют общий сульфадимезин, т.е. ацетилированный и свободный вместе, а в пробе, которую не подвергают гидролизу - свободный сульфадимезин.Далее обе пробы, гидролизованную и негидролизованну 1 о, ставят в холодильник при 40 С на 30 мин, Сразу после охлаждения в холодильнике в обе пробы приливают по 0,1 мл 0,2 -ного аэотистокислого натрия Май 02 (раствор МаМО 2 должен быть свеже- приготовленным, т.е. готовят в период, когда пробы находятся в холодильнике). Пробы перемешивают встряхиванием и точно через 4 мин приливают по 0,1 мл 1,0-ного раствооа аммония сульфаминовокислого, встряхивают, Через 2 мин приливают 0,2 мл 0,01 -ного раствора И-(1)-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида, Пробы помещают в темноту на 1 ч врез каждые 25 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность исследуемого раствора определяют на приборе микрофотоколориметре МКМФпри длине волны 540 нмв кюветах с толщиной слоя 1 см относительно "холостого" опыта, который ставят параллельно гидролизсван ной и негидролизованной пробам, но в котором зкстрагировали измельченный квадрат чистой фильтровальной бумаги размером 25 х 25 мм. Расчет количества сульфадимезина (мкь;оль) в пробе ведут по калибровочной кривой. Определяют количество общего сульфадимезина в гидролизованной пробе и количество свободного сульфадимезина - в негидролизованной пробе. По разнице между общим и5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 свободным сульфадимезиномнаходят ацетилированный сульфадимезин.Активность ацетилирования вычисляют по процентному отношению ацетилированного сульфадимезина к общему.В результате проведенного исследования у каждого из 20 кроликов по полученному проценту ацетилирования устанавливают ацетилдторный фенотип. Если определенный процент ацетилирования ниже 50, то обследуемый кролик с медленным типом ацетилирования, если выше 50 ф, то с быстрым типом ацетилирования.Иэ обследуемых 20 беспородных кроликов в результате фенотинирования было выявлено 10 кроликов с быстрым типом ацетилирования, у которых средний процент ацетилирования составлял 71,7 ф 1,2 и 10 - с медленным типом ацетилирования, где процент ацетилирования в среднем равнялся 32,9 а 4,7. Иэ тестируемой группы далее отбирают 5 кроликов с медленным и 5 кроликов с быстрым типом ацетилирования и через 1-2 дн вводят внутрибрюшинно (натощак) испытуемый препарат белый стрептоцид в той же эквимолярной дозе 0,072 ммоль на 1 кг массы тела. Через 1 ч берут кровь 0,15 мл из краевой ушной вены в центрифужную пробирку. После центрифугирования в сыворотке определяют только концентрацию активного неизменного препарата, Для этого к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,5 мл 20-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков и 1,4 мл дистиллированной воды. Общий обьем 2,0 мл. Тщательно перемешивают содержимое пробирки и проба стоит 15-20 мин,Далее пробу центрифугируют при 3000 об./мин, Отбирают 0,5 мл центрифугата в пробирку с размером внутреннего диаметра 10 мм и высотой 120 мм. Прибавляют к центрифугату 0,1 мл 4 н.НС 1, перемешивают встряхиванием, Помещают пробу в холодильник при 4 С на 30 мин, Сразу после охлаждения приливают 0,1 мл 0,2-ного азотистокислого натрия йай 02 свежеприготовленного). После каждого добавления реактивов содержимое пробирок тщательно перемешивают встряхиванием. Через 4 мин 0,1 мл 1.0-ного раствора аммония сульфаминовокислого, через 2 мин - 0,2 мл 0,016-ного раствора й.(1)-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида. Пробу помещают в темноту на 1 ч и через каждые 15 мин встряхивают для удаления пузырьков газа. Оптическую плотность измеряют на приборе микрофотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см относительно "холостого" опыта, который ставят параллельно с пробой, добавляя вместо сыворотки 0,1 мл дистиллированной воды.В сыворотке крови, определяли концентрацию активного свободного белого стрептоцида в мкмоль/л, которая у медленных кроликов была: 105, 103, 105, 217, 181 - в среднем 142+22, а у быстрых 158, 89, 173, 165, 110 - в среднем 13916, т,е, не превышает 30. Таким образом, концентрация свободного белого стрептоцида в крови при одинаковой дозировке не различается у медленных и быстрых ацетиляторов,Концентрация свободного активного белого стрептоцида у 20 беспородных кроликов составила по известному способу 142- 10 мкмоль/л,Таким образом, белый стрептоцид инактивируется в организме мономорфной системой ацетилирования и можно не учитывать его тип ацетилирования, как при применении этого препарата для изучения биологической активности, так и для лечения.Применение предлагаемого способа позволяет повысить точность определения биологической активности сульфаниламидов на 30 по сравнению с известным,Формула изобретения Способ определения биологической активности сульфаниламидов путем введения исследуемого препарата экспериментальному животному и определения концентрации свободных и ацетилированных форм препарата в крови, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения. осуществляют забор 0,075-0,15 мл крови, выявляют медленный и быстрый ацетиляторный фенотип и при превышении концентрации препарата у медленных ацетиляторов посравнениюс быстрыми на 23 и более определяют биологическую активность сульфаниламида.