Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к интерферону типа омега

ОЮЗ СОВЕТСНИХ ОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК юЯО,в 1 6023 12 Р 211 1)5 С 12 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПАТЕНТ Р 39 ейм Интернацио(57) Изобретной технологиизовано при пФерону типашцзсц 1 цз Ь. е относится к гибридоми может быть испольлучении монАТ к интермега. Животное Мцз.подвергают двукратнойгибридным интерйероном -она типа омега - 1 и 1 ч иммунизации 1 ч. интерй сится к гибрипом-;жет быть испольи монАТ к интерйеИзобретение отной технологии и ой ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГГИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Берингер Ингельналь ГмбХ (ЭЕ)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ 1ПРОДУЦИРУЮР 1 ЕЙ МОНОКЛА К ИНТЕРФЕРОНУ ТИП зовано при полученирону типа омега.Способ осуществляют следующимобразом.Селезеночные клетки животного,шедшего предварительную иммутизациинтерфероном типа омега или гибриным интерйероном, состоящим из одчасти интерЬерона типа омега., иодной части интерйерона типа альФпредпочтительно интерйероном типаомегаили интерйеронами типов огаи альФа- и последующую доно интерФерона типа Ы -2 и затем двукрат.ной иммунизации интерйероном типаомега, Полученные иммунные клеткиселезенки культивируют в сывороточной среде для кисточной культуры.Получают миеломные клетки линииРЗХ 63 Ая 8,653. Клеточные культурыраздельно промывают и суспендируютв бессывороточной среде для клеточнойкультуры. Суспензии объединяют, суспендируют осадок в среде, содержащей457 КРМ 1 1640, 503 ПЭГ и 53,ТИСО,суспензию встряхивают, добавляют бессывороточную среду для клеточнойкультуры, а затем среду с 107 эмбриональной телячьей сыворотки. СмесьцентриФугируют, осадок суспендируютв среде с 20 Х эмбриональной телячьейсыворотки, гипоксантином, аминоптериром и тимидином, В суспензию вводятперитонеальные макройаги, инкубируюти отбирают целевой продукт.,нительную иммунизацию интерФерономтипа омега, предпочтительно интерфероном типа омега, подвергаютслиянию с миеломными клетками, которые предпочтительно сами не продуцируют антитела, например с миеломнымиклетками линии РЗХ 63 Ае 8,653,Получаемые при этом гибридомныекультуры подвергают скринингу с цельюидентийикации тех клонов, которыепродуцируют направленные против интерйерона типа омега моноклональныеантитела (монАТ). Для этой цели,например, исполвзуют биологическиеопыты, которые могут подтвердитьвылияемую полученными янтителамилейтон.лиэяцию биологических активностей интерАероя гипа омега, например антивирусной активности,Из полученных по способу пяти5культур, которые обозначают какОЦГ, ОМГ, ОМГ, ОМГи ОМГ и которые проявляют существенноеуменьпение антивирусной активностиинтерАероня типа омега, выбираютклоны ОМГ, ОМГи ОМГ, которыеиспользуют для производства монАТ,Для этой цели выбранные линии гибридомных клеток культивируют .и ч.чоили 1 п ч.го, Клетки выбранных клонов инокулируют в мьппей породыВа 1 Ь/с, которым предварительно вводят пристян или неполную среду Фройнда, Через 7-18 дней собирают асцитную жидкость, из которой монАТ выделяют путем осаждения сульАатом аммония и последующей аААинойхроматограАии или же другими известнымиметодами, Образовавшиеся антителяможно также только обогащать в осцитной жидкости,Образовавшееся антитело можно аналогично обогащать или же выделять из нясадочной жидкости соответствующей клеточной культуры, подготовленной 1 п чайно, Получаемое по способу монАТ можно использовать не только для доказательства наличия интерАерона типа омега, но и для очистки интерАерона типа омега, предпочтительно интерАерона типа омега.Если получаемое монАТ предназначено,пля тонкой очистки интерфероня типа40 омега, то его предпочтительно ковалентно связывают с биологически неактивным носителем. При этом ковалентная связь антитела осуществляется на соответственно активированном45 носителе, предпочтительно на декстрановой основе, например, на активированной бромистым цианом или группой СН сеАарозе. При этом подлежащий очистке интерйерон типа омега, например омега, в виде раствора пропускают няд полученным монАТна носителе при слябоосновной величине рН, например при рН 7-8, предпочтительно 7, 5, после чего промывают при рН 7,5 до тех пор, пока клюат больше не содержит протеина, Затем связанный интерАерон элюируют в кислой области, например, при 1 омощи 0,1 М .лимонной кислоты в 257 ном этиленгликоле. Получаемые такимобразом содержащие протеин Арякцииподвергают хромятогряАии на сильнокислом катионите, например, на катионите Моно-С. При этом человеческий интерАерон в упомянутом элюатенемедленно абсорбируется катионитом и затем элюируют при помощи градиента хлористого натрия.Если монАТ используют в качествеантигена для доказательства наличияили для количественного определенияинтерАерона типа омега, то можно использовать общеизвестные методы сиспользованием иммунопроб,П р и м е р 1. Получение моноклоняльных антител, специйическихотносительно интерферона типа омега.Иммунизация.Самку мьппи типа Ва 1.Ь/с возрастаоколо восьми недель подвергают иммунизации высокоочищенным (степень.истоты 957) гибридным интерАерономтипа омега/Ы 2 следующим образом.Первая иммунизация: 200 мкг указанного интерфероня вместе с полным адъювантом Фройнда (внутрибрющинно),вторая иммунизация: 200 мкм указанного интерАерона вместе с полным составом добавки Фройнда (внутрибрюшинно),Вторая иммунизация осуществляется по истечении 5 недель после первой иммунизации. По истечении восьми недель после второй иммунизации мьппь подвергают дальнейпей иммунизации с помощью 70 мкг очищенного интерАерона типа омега(степень чистоты у 9 ОХ) при использовании неполного адъюванта Фройнда (внутрибрнипинно). Через 12 дней берут пробу сьворотки, Опыты по нейтрализации показывают, что сыворотка мыши имеет относительно высокие титры нейтрализующих антител против интерАерона типа омегаполная нейтрализация при разбавлении сыворотки до 1000-кратного, частичная нейтрализация при 1000-кратном разбавлении). Опыт по нейтрализации осуществляют следующим образом: 100 мкг разбавленной пробы сыворотки в среде клеточньгх культур5 16023 смешивают с 100 мкг раствора интерАероня типа омега(100 антивирусных ед./мл) и в .течение 90 мин инк убир уют при 3 7 С . Затем антивир ус нуюоактивность проб определяют биологичес 5 ким методом с использованием клеток А 549 рака легких, инФицированных вирусом энцеАяло-миокардита, Через 5 недель после третьей иммунизации10 мышей еще раз иньецируют 70 мкгочищенного интерАерона типа омега(степень чистоты )90%) без добавки,936эмбрионял ной телячьей сыворотки.Клетки собирают центриФугированием,суспендируют н 400 мл среды ГАТ (сдобавкой 20% эмбриональной телячьечсыворотки, гипоксянтина 1,бх 10 М,яминоптериня 4 х 10 И и тимидина1,6 х 10 М). К этой суспензии прибавляют перитонеяльные мякроАаги измышей породы Ва 1.Ь/с (приблизительно50000 кл./мл),Получение и скрининг гибридом. 20 Получение гибридом осуществляют при использовании несецернирующих клеточных линий РВХбЗАя 8,653. По истечении 4 днеч после последней иммунизации берут селезенку мыши; клетки селезенки механически удаляют из ткани, суспендируют и среде для клеточной культуры (среда: КРМ 1 1640 с добавкой пенициллина н виде натриевой соли; 100 ед/мл) и стрептомици.25 на в виде сульАятной соли (50 ед/мл) и це нтриАугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин н центриАуге типа Бекмянн Т 1-6, 2 х 1 О" миеломных клеток (культивированных в упомяьуточ среде с добавкой 10 Х эмбриональной телячьей сыворотки) сосиряют центриАугиронанием и проминают один раз бессивороточной средой для клеточной культуры, Клетки селезенки и 35 миеломные клетки затем повторно суспендируют н бессынороточной среде для клеточной культуры, суспензии . соединяют и повторно центриАугируют. Недостаточную жидкость удаляют, клет ки суспендируют н 3 мл среди, состоящей из 45 Х среды ВР 11 1640, 50% лов лиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000 и 5 Х диметилсульйоксида, и в течение 90 с осторожно встряхивяот, 45 Затем оставляют стоять в течение 60 с, В течение 90 с по каплям прибавляют 3 мл бессывороточной питательной среды, суспензию в течение 60 с оставляют стоять, зятем по кяп лям в течение 90 с добавляют дань - нейшие б мл бессывороточнос. пнтятель - ной среды и, наконец, постсяссно пе - ремешивая, медленно прибавляют 1 мл питательной среды с 10% эмс рионяльной телячьей сиво;глотки, оста вляют стоять в течение 10 мин н затем доводят до объема 50 мл добавлением среды для клеточной культуры с 10; Суспензию пипеткой подают на пластинки, каждая из которых снабжена48 углублениями (каждое углублениеимеет емкость 0,5 мл), Пластинки инкубируют при 37 С (95% воздуха, 5% двуокиси углерода, насыщение восдяньм паром), По истечении трех дней к каждой культуре прибавляют 0,5 мл среды ГАТ. Из всего 800 исходных культур по истечении 2-3 недель приблизительно 300 культур показывают рост гибридомных клеток. Последую 1 с 1 ий скрининг осуществляют следующимобразом. Надосадочные жидкости по меньшей мере 10-20% слитых гибридомных культур смешивают с одинаковым объемом раствора человеческого интерФерона типа омега(20 антивиральвых ед./мп), инкубируют в течение 90 мин при 37 С и затем исследуют по меньшей мере два разя с соблюдением промежутка в одну неделю, 5 из культур, которые далее обозначаются как ОМГ, ОИГ, О 11 Г-б, ОМГи ОМГ-Я, во всех опытах всегда проявляют уменьшение антивирусной активности. Все культуры клонируют путем лимитирующего разбавления и клоны снова исследуют ня нейтрялизующую яктчвность. Из каждой культуры 3-5 положительных клонов подвергают дальнейшей обработке, Для получения антител6 ня живом организме 3-10 х 10 клеток каждой гибридной культуры внутрибрюсо:и:.то инокулируют и мьсши породы Вя 1 Ь/с, которым зя 2-3 дня до этого внутрибрюшинно инъецпруют 0,5 мл неполного,адъсовянтя Фройндя или за 7-10 дней до этого - 0,5 мл пристава, По истечении 7-21 дня собирают образовавшуюся асцитную жидкость. Содержащиеся в ней антитела обогащают до степени чистоты выше 90% путем осаждения 50% сульФата аммония и аФФинной хромятаграФии на связанном с носителем лротеине А, Для всех гибридом ня 1 мл асцитной жид 1602393кости получают приблизительно 2-5 мгчистого антитела,Характеристика антител ОМГ,ОМГи ОМГ.5При электрофореэе на полиакриламидном геле с использованием доденилсульфата натрия, проводимом вневосстанавливающихся условиях, ижидкостной гель-хроматограФии поддавлением все антитела проявляютудерживающую характеристику, идентичную с иммуноглобулином Г. В опыте понейтрализации, в котором исследуютторможение. антивирусной активностиинтерферонов, все антитела в концентрации 100 микг/мл нейтрализуютактивность интерферона типа омега,но не активность интерферона типовальфас, бета и гамма, Вышеуказанные клоны дегонированы под номерами 87081404 (ОМГ), 87081402(ОМГ) и 8708 1403 (ОМГ - 7)в Ецгореап Со 11 есй 1 оп оГ Ап 1 ша 1 Се 11Сц 1 Сцгев, Сепге аког Арр 11 ео М 1 сгоЬ.о 1 ору апЛ КезеагсЬ (Великобритания).П р и м е р 2, Анализ с использованием связаннойс энзимом пробыдля определения ин терферона типаомега .Антитела ОМГи ОМГковалентно связывают с пероксидазой из хрена. Для этого 2 мл пероксидазы в воде 3смешивают с 0,2 мл 100 мМ перйодатанатрия, встряхивают при комнатнойтемпературе в течение 40 мин и подвергают диализу приС в течение но,очи при рН 4,4 с использованием 402 х 500 мл 1 мИ ацетата натрия, Затемраствор доводят до рН примерно 8добавлением 0,1 М бикарбоната натрияс рН 9,5. К раствору добавляют раст-.вор.моноклонального антитела (ОМГ, 452 мп с 1,б мг/мл; или ОМГ, 1,5 млс 4,7 мг/мл, каждый раз в 10 мМ бикарбоната натрия с рН 9,5), послечего встряхивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляют100 мкл раствора бората натрия(4 мг/мл ввода) и раствор инкубируютна ледяной бане в течение 2 ч, Затем по каплям добавляют 3 мл холодного насыщенного раствора сульфатааммония и инкубируют на ледяной бане в, течение 1 ч, Образовавшийся осадов, связанный с пероксидазой иммуноглобулина, собирают путем центриФугирования, растворяют в содержащеми ФосАатный буфер изотоническом растворе поваренной соли с рН 7,4 и стабилизируют путем добавления 1 мл раствора альбумина сыворотки крупного рогатого скота (10 мг/мл в содержащем фосфатный буфер растворе поваренной соли). Получаемый раствор замораживают при минус 70 С.Определение интерферона типа омегас использованием связанных с энзимом иммунопроб на твердом носителе осуществляют следующим образом, Для покрытия пластинок используют антитела ОМГ, ОМГили ОМГв конпентрации 10 мкг/мл в 0,1 М карбоната натрия с рН 9,5 (100 мкл на углубление) и пластинки инкубируют либо при комнатной температуре в течение часа, либо при 4-8 С в течениеоночи. Раствор антитела удаляют, углубления промывают 200 мкл воды и заполняют 100 мкл раствора альбумина сыворотки крупного рогатого скота (5 мг/мл) в содержащем Фосфатный буфер изотоническом растворе поваренной соли с рН 7,4 (далее "раствор АС/ПС"). Затем добавляют 100 мкл раствора интерферона типа омегас концентрацией 20 нг/мл и перемешивают. Затем во все углубления подают 50 мкл раствора, связанного с энэимом антитела (ОМГ/пероксидаза или ОМГ/пероксидаза), (раствор разбавлен в соотношении 1:10000 в АГ/ЛС) и пластинки инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, Затем раствор удаляют, углубления трижды промывают водой и заполняют 100 мкл субстратного раствора (3 мг/мл о-фенилендиамина, 1 мг/мл пербората натрия в 0,067 М пчтрата калия, рН 5). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре в каждое углубление пипеткой подают 100 мкл 4 н серной кислоты, после чего замеряют оптическую плотность при 492 нм. При всех исследуемых пробах (используемое для покрытия антитело и связанные с пероксилазбй антитела) достигаются зависящие от дозы изменения абсорбции, Для выполнения покрытия также используют 10 мкл/мл иммуноглобулина против интерферона типа омега, полученного путем двукратной иммунизации кролика интерфероном типа омегаи частичной очистки из сыворотки осаждением 50 ь-ным сульфатомО 1602393 Формула изобретения Составитель Г.СмирноваРедактор В,Бугренкова Техрел Л.Сердюкова Корректор Н, Король Тираж 485 Заказ 3280 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета ио изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-изд;п ельский кобии г "1 атент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 аммония, Анализ с использованиемсвязанной с энзимом пробы можно использовать не только для количественного определения интерАерона типаомега, но и, например, для определения содержания типа омегавлейкоцитарных интерАеронах или других интерАероновых препаратах, полученных из клеточных культур,П р и и е р 3, Определение интерАерона типа омега путем иммунометрии,Антитело ОМГизвестными приемами маукируют системой -сукцинимидил(2,3 Ч) пропионат (далее: " Н-йСП";110 С/ммоль), Для этой цели в силиконизиронанной емкости в вакуумесушат досуха 1 мС раствораН-ИСП,Затем пипеткой добавляют 50 мкг раствора мон АТ ОМГ(4,7 мг/мл) в содержащем буАер растворе повареннойсоли с рН 7,4 и 3 мкл 1 М боратного буАера с. рН 8,5. По истечение 24 чпри 4 С избыточньп";Н-СП удаляют 25о20 мкл 1 М глицина в боратном буФере,разбавляют 250 мкл 50 м калий-АосАатного буФера с рН 7,4, 150.м 11хлористого натрия и 5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота и отделяют от маркированного антитела путем хроматограАии на колонке(0,5 х 20 мс), содержащей сеФадексй 1С 50 М. Антитело показывает специФическую активность примерно 10 С 1/Гпротеина, Дпя осуществления опыта протравленные полистирольные шарики диаметром 6,5 мм снабжают покры-.тием из антитела ОМГ(10 мкг/мл в 0,1 М карбоната натрия с рН 9,5; 40 1 ч при комнатной температуре), арики подают в раствор АС/ПС, инкубируют в трубках в течение часа и затем два раза промывают 250 мкл воды, К шарикам добавляют 200 мкл раствора 45 интерАерона типа омеган понышающихся концентрациях и ЛС/ПС, инкуби - руют при 4 С н течение 3 ч, послео чего трижды промывают 250 мкл воды, Затем добавляют 200 мкл раствора маркированного антитела (100 нг/мл в АС/ПС; на трубку примерно 27000 имп/мин) и инкубируют при 4 С в тео чение 20 ч, Затем шарики трижды промывают 20 мкл воды, переводят в полипропиленоные трубки и добавляют 4 мл сцинтиллирующей среды, после чего замеряют связанную радиоактивность,Использование изобретения позволяет получать монАТ высокой специАичности к интерАерону типа омега. Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к интерАерону типа омега, заключающийся в том, что животное Моя,шцяси 1 ия 1 подвергают двукратной иммунизации гибридным интерФероном, состоящим из 1 ч интерАерона типа омегаи 1 ч, интерФерона типа о, и затем двукратной иммунизации иитерАероном типа омега, полученные иммунные клетки селезенки, предварительно прокультивиронанные в сывороточной среде для клеточной культуры, и миеломные клетки несецернирующей линии РЗХ 63 А 8 8,653 раздельно промывают и суспендируют в бессывороточной среде для клеточной культуры, далее суспензии объединяют, центриАугируют,осадок суспечдируют в среде, содержащей 45% КРМ 1 1640, 50 полиэтиленгликоля и 5% диметилсульАоксида, суспензию встряхивают, добавляют бессынороточную среду для клеточной культуры, а затем среду с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, центриФугируют, осадок суспендируют н среде с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантином, аминоптерином и тимидином, в суспензию вносят перитонеальные макрофаги мышей, инкубируют и отбирают целевой продукт,