Способ получения цианидгидратазы

(72) Кеннет и Питер Мор (53) 577.15 (56) ЕР Р 0 опублик. 19 ичардсонСВ) аимонд Кларк 088.8) у кл, С 02 Г 6122,НИДГИДРАТА ится к биотех вышение Изобретение отн огии и касается ратазы к.2.1, под названием Ж сится к биотехполучения цианид 6 (известный так ным штаммом являег 1 з.цтп 1 еея Предпочтитель ся Гцяаг 1 цш 1 аг СМ 1 3005333, не рмамидгидроли же огенныи п но- едуюшению к пшенице и обладающиииками. ие характерис о Яцсгояе Аеа и нарезанного ки,(РВА)артовают котел и выдержинии 15 фунтов н ение 15 мин. О вар ез два слоя мусл ному Аильтрату 2 ра, выдерживают диспергируют. х (моди,эицирова А)ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ ГКНТ СССР юл. Р 39микал Индастриз НЛС 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯЫ57) Изобретение отноологии, 1 ель изобрет за),Цель изобретения - повьпцение активности целевого продукта.Способ заключается в подборе условий ферментации продуцирующего фермент микроорганизма и добавлении впроцессе культивирования к культ уре цианид-ионов и/или цианистого водорода,что обеспечивает превращение нх в цианистоводородную кислоту, и предусматривает использование таких бактериальныхмикроорганизмов л грибков, какБсетпрЬУ 1 цш 1 ос 1 АТСС 11718, Мусо 1 ергой 1 ясця геггеясг 1 я СВБ 231 53,Рцяагдцш шоп 11 огпе СВБ 16182, Нс 1 -пппСЬоярог 1 ци яогрЬ 1 со 1 а СВ. 249,40,активности целевого продукта. Способполучения цианидгидратазы включаетнепрерывную культивацию штамма микроорганизма при определенных температурах, рН и скорости разбавления,а также непрерывном введении в культуру цианид-ионов и/или цианистоводородной кислоты в концентрациине менее 15 ммоль. Фермент стабиленв течение до 130 дней. Предпочтительным микроорганизмом являетсяштамм Рцяаг).цш 1 асег 1).цш асеевСМ 1 300533, депонированный в соответствии с Будапештским соглашениемв Микологическом институте здравоохранения, Кем, МсЬпопй, Бцггеу,Великобритания. 6 з.п. ф-лы, 1 ил.2 табл. Репсопьа сгспаса СВБ 263 37, С 1 ошеге 11 а гцсашапепя).я СВЯ 132,37. " щими характерис Морфологичес Среда (1) Рога 250 г промытого феля помещают в в нем при давле 1 кв. дюйм в те процеживают чер добавляют к мут глюкозы и 2 Е аг ду в автоклаве и"ОхоЫ" - зарегистрированный товарный знак,оУсловия культивации: 25 С, нескбпько недель.Скорость роста: 4,0 см за 3 дня,3,0 см за 3 дня соответственно,Характеристика роста: хлопьевидноопушенно разрастающиеся колонии сбелым воздушным мицелием. Субстратна РВА серовато-розовый с пятнамималинового цвета, переходящего в желтый, несколько более бледный на СЭА,Иногда образуется пигмент темно-красного цвета, в частности при старении,Через одну-две недели воздушный мицелий приобретает коричневую окраску и разрушается. Колония при этомстановится довольно слизистой, образуются спосодохии от розового докоричневого цвета на РВА и оранжево-розового на СРА.Выделение жидкости не происходит,Цвет образующегося пигмента обычнотакой же, как и мицелия, 25Конидии. Микроконидии в случаеэтого организма не образуются. Микроконидии образуются из однолатеральных Фиалид или мультиразветвленных конидиофор с короткими Фиалидами. В более старых культурах конидиофоры аггрегируют с образованием спо родохий, в частности, на СРА, Формаконидий может изменяться от серповидной до.искривленной ЕцзоЫ спиннобрюшной, с количеством перегородок3-5, обычно 5 в более молодых, культурах. Размер спор находится в пределах (25-30)х(2,5-4,0) мкм,Опорная клетка часто имеет ножку40в частности в случае спор с болеечем 5 перегородками В мицелии попадаются набухшие клетки,.иногда встречаются хламидоспоры, интеркалярные,одиночные или звеньями,рибки могут расти в двух различных Формах, шарообразной или гранулообразной, а также в дисперснойформе, когда они представляют собойдиффузные волокнистые пряди,диспергированные в питательной среде. При50использовании для обработки материалов важно, чтобы грибки росли в дисперсной, а не в шарообразной илигранулообразной форме. Поскольку рост55в гранулообразной Форме тормозитсяза счет диффузии питательных веществи газов через гранулы, процесс культивации в этом случае является неэффективным. Условия культивациипредлагаемого способа должны бытьблагоприятными для роста грибков вдисперсионной Форме.Грибковый штамм может быть выращен в условиях кислородного или углеродного контроля. Предпочтительнымиявляются условия, когда эффективныйрост осуществляется при одновременном кислородном и углеродном контроле, В качестве питательной среды используют среду определенного состава, а именно содержащую помимо источника углерода минеральные солибез добавок каких-либо неопределенныхорганических материалов, таких какдрожжевой экстракт,В качестве источника углерода дляосуществления предлагаемого способаможно использовать любой подходящийисточник. Предпочтительно использовать для этой цели глюкозу, Источником азота являются сульфат и гидроокись аммония, а источником Фосфора - .фосфат калия и Фосфорная кислота.Основные компоненты питательной среды используемой при осуществлениипредлагаемого способа, содержатся вней в следующих количествах, г:Нз РО 4. 10-20 мМ800-1400М 8804 7 НО 700-1200Глюкоза Н О 10000-400000 чн,),ВО, 500-3000Микроэлементы О, 1-20Оптимальная питательная среда,вводимая в культуру в стационарныхусловиях, имеет следующий состав,г/л ф1,1 мнРо 320 мп/20 лМикроэлементы ибиотин 10 мл/20 лК,8 О, 20/20мазо 7 н о 18/20ГлюкозаН О 223/20(ин,),яо, 50/20Состав раствора микроэлементови биотина. (в растворе на 1 л), г:РеС 16 Н О 9,6СНО 5 й,о3,6мяо," 4 н,о30,0Кп 8 о 7 Н О 38,0Биотин г 0,52 Цианид-.ионы или цианистоводородная киелота вводятся в культуру отдельно или вместе е другими питательными веществами на стадии культивации5 16предла гае мог О с пос Оба . Пр едпочтител ьно цианиди добавляют к питательнойсреде, вводимой н культуру, в видецианидов щелочного металла, например цианида калия или натрия. Вначале стадии культивации цианидыдобавляют в небольпптх количествах, которие затем, по мере гриспособленияк ним клеток грибка в культуре, постепенно увеличивают и в уже установившихся стационарных условиях вводят н концентрации как минимум15 ммоль в расчете на общее количество питательной среды в культуре (т.е.в расчете на суммарное количествовсех жидких питательных веществ вкультуре), предпочтительно н количестве 10, наиболее предпочтительно4-6 ммоль/г сухих клеток. Обнаружено, что с ростом концентрации цианид-ионов в питательной среде, вводимой н культуру в стационарных условиях, увеличивается активность Фермента цианидгидратази, причем величина его активности линейно зависитот концентрации цианид-ионов, Так,например, активность Ферманта, вираженная в микромолях Образуюпегося н1 мин ца 1 л культуры Формамида, принеболыиом содержании (20 ммоль) ранна 220,Предпочтительными являются следующие условия культивации предлагаемого способа: скорость разведения0,05-0,1 ч , рН 5,0-6,0 предпочтиотельно 5,5; температура 28-32 С,предпочтительно 30-32 Г. В этих чсловиях активность получаемого Ферментамаксимальна. 02394 1 О 15 20 В процессе кчльтцвацни, кчльтура непрерывно отводится из Фермецтятора, в котором проводится культивация. Клетки, содержащие Фермент цианидгидратазу, отделяют От виводимой из Ферментатора культури любим подходящим способом, предпочтительно путем Фильтрации. Отделенцие клетки могут бить висушеци и подвергцути затем дальнейшей Обработке, например экструзии, для по:тучецця содержащего ццаццдгцдратазу кцеточцого материала в любоц цужцой Форме, ця - пример, в виде агрегатов илц порошка. Фермент может бить также Отделен 25 30 35 40 45 Содержап 1 ий цианидгидратазу материал, полученный по предлагаемому способу, может использоваться для обработки цианидсодержащих сточных вод. Полученный предлагаемым способом Фермент обладает высокой стабильностью (период полураспада его, например, может составлять до 130 дней) и высокой активностью, Высоко- стабильный Ферментосодержащий материал может быть получен, если стадию культивации предлагаемого способа проводить в условиях кислородного или одновременно кислородного и углеродного контроля. Фермент, содержащий материал с высокой активностью, может быть получен при проведении стадии культивации предлагаемого способа при 30-32 С. П р и м е р 1. Пианидгидратазу получают путем культивации штамма Гизагштп СМ 1 300533 в присутствии НСИ непрерывным способом, вводя в культуру питательную среду указанного состава на глюкозе, Культивацию проводят н стационарных условиях при различных температурах, рН 5,5 и скорости разбавления 0,10 ч . Полученние результаты сведены в табл, 1, из которой видно, что максимальная активность Фермента достигается при температуре культинации 30-32 С, ао при более низких температурах получаемая активность вдвое меньше максимальной, При температуре вьппе 34 Со роста культуры не происходит. Активность Фермента выражена н микромолях Формамида, получаемого в минуту из 100 ммоль цианида натрия при рН 8,5,Л р и м е р 2. Цианицгидратазу получают путем культивации штамма Гцзагщч 1 аС 1 гС 1 цш СК 1 300533 в присутствии НГЧ непрерывным способом, вводя н культуру питательную среду указанного состава на глюкозе. Культивацию проводят н стационарных условиях при различной скорости окисления и постоянных рН (5,5), температуре (30 С) и скорости разбавления (О, 10 ч). Образующийся Фермент подвергают сублимационной сушке иохранят при 4 С над силикагелем. Стабильность полученного фермента контролируют путем анализа аликвотных проб через определенные промежуткиОт клеток и ислользоцлться в ветомниде. Обичцо н этом цет необходимости, поэтому, как правилО, ферментце Отделяют От клеток. времени,Полученные результаты сведены втабл. 2, из которой видно, что ста 160239440 бильность Фермента при хранении возрастает, если культивация проводитсяпри одновременном кислородном и углеродном контроле,П р и м е р 3, Индукционный проФиль цианидгидратазы определяют путем культивации штамма ГдзагышСМ 1 300533 непрерывным способом,вводя в культуру питательную среду . 10указанного состава на глюкозе. Культивацию проводят в стационарных условиях при различных концентрацияхНСИ, поддерживая постоянными рН(5,5), температуру (30 С) и скорость разбавления (0,10 ч-),На чертеже приведен граФцк линейной зависимости между индукцированной активностью и концентрацией цианида, 20Линейность сохраняется до концентрации цианида в питательной среде какминимум 24 ммоль На граФике по осиординат отложен номинальная концентрация цианида, а по оси абсцисс 25общая активность.П р и м е р 4,11 тамм Гцзагхцш СМ 1300533 вырашива ют непрерывным способомв емкости объемом 6000 л с испопьзованием питательной среды указанного состава, 30содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Скорость роста контролируют концентрацией глюкозы. рНподдерживают в пределах 5,0 и 5,8,скорость разбавления составляет 0,080,1 ч , температура 30-32 ОС. 11 ианиднатрия добавляют к питательной средев количестве 61,5-73,5 ммоль. Культивацию проводят в условиях кислородного голодания, для чего уменьшаютинтенсивность аэрирования. В результате происходит образование этанолав количестве 0,81 г/л. За 140 чполучено 12,2-14,3 г/л биомассы сактивностью цианидгидратазы 81,0 - 45122,4 ед, т,е, 81,0-122.,4 мкИольформамида в 1 мин на 1 мг сухого веса (для анализа брали 120 ммоль раствора цианида при рН и температуре20 С),Ф о р и ул а и з о б р е т е н и я1. Способ получения циаяидгидратазы, предусматривающий непрерывноекультивирование в условиях аэрациипродуцирующего Фермент микроорганизма в водной питательной среде, содержащей источник углерода, приемлемыйдля данного микроорганизма, неорганические питательные вещества и раствор микроэлементов, при непрерывнойподаче источника цианид-ионов и/илицианистого водорода с последующимвыделением клеток, содержащий цианидгидратазу, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, культивирование ведут при 28-32 С, рН4,5-7,5 и скорости разбавления средыв интервале 0,05-0,11 ч, а. минимальную концентрацию цианид-ионови/или цианистого водорода, вводятв питательную среду, устанавливаютне менее 15 ммоль.2, Способ по и, 1, отличающ и й с я тем, что продуцирующимФермент микроорганизмом являетсяштамм Рцзагцш 1 асхгецш асеев СМ 1300 533.3, Способ по п. 1, о тл и ч а ющ и й с я тем, что источник цианидионов и/или.цианистого водорода добавляют к культуре в количестве,эквивалентном 2-10 ммоль/г сухихклеток,4, Способ по п. 1, о т л и ч а юш и й с я тем, что источник цианидионов и/или цианистого водородадобавляют в концентрации 4-6 ммоль/гсухих клеток,5. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве источника углерода используют глюкозу.6, Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что культивированиеведут при рН предпочтительно 5,0-6,0.7, Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что культивированиеосуществляют предпочтительно при30-32 С,1602394 1 О та блица 1 Температура, С,ммоль С рН Удельная активность, Скорость разбавлеед./мг сухого веса ния, чТ а б л и ц а 2г Период полураспада, дн. Оксигенация Аэробные условия Средняя аноксия Жесткая аноксия 21 63 90 20 Составитель И.Приваловнева Техред Л.Сердюкова орректор.Л.Бескид Редактор С аказ 3280 НИИПИ Госу Тираж 479 писное КНТ СССР твенного комитета по 113035, Москва, Ж - 3