Способ количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на нерастворимых носителях

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫХ ПО ОТНОШЕНИЮК ПАРА-НИТРОАНИЛИДАМ АМИНОКИСЛОТФУНКЦИОНАЛЪНЫХ ГРУПП НА НЕРАСТВОРИМЫХНОСИТЕЛЯХ.(57) Изобретение относится к химииполимеров и аналитической химии ипозволяет проводить количественноеопределение реакционноспособных поотношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на полимерных и минеральных носителях сточностью выше ЗЕ по упрощенной методике. Зто достигается обработкой ноИзобретение относится к химии полимеров и аналитической химии, а именно к способу количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на нерастворимых носителях, и может быть использовано в биотехнологии при анализе реакционноспособных полимеров и их производных.(50 4 В 01 Л 20/26 С 01 Я 21/33 сителя и-нитроанилидом аминокислотыо в течение 2-20 ч при 10-60 С, спектрофотометрированием при длине волны= 310 нм и расчетом количества функциональных групп (мкмол/г) по(п Р+Рр -и Р) ч т 10 формуле С ---------- МпР,ч р где Р - оптическая плотность разбавленного раствора реактива; Р - оптическая плотность буферного растворапосле обработки носителя; Р - оптическая плотность разбавленного раствора реактива после обработки носителя; и - кратность разбавления раствора реактива до и после обработкиносителя; ш, - масса навески реактива, г; ч - объем мерной колбы, взятой для приготовления раствора реак- .тива, мп; О - масса навески анализируемого полимерного носителя, г; ч -объем реактива, взятого для контактирования с носителем, мл; М - молекулярная масса п-нитроанилида аминокислоты, 4 табл. Цель изобретения - повышение. чувствительности и точности анализа и упрощение процесс,Реакционноспособными функциональными группами, определяемыми согласно предлагаемому способу, являются альдегидные группы (-СНО), и-бензохиВ( - я=Щ; ) иодацетильные (СН 1-СООСН),бромциановые (СИВг-), взаимодействующие с п-нитроанилидами аминокислот5н,с-сн-соянхо,).В качестве п-нитроанилидов аминокислот используют и-нитроанилидыЬ-лейцина, глицина, Ь-аланина; вкачестве нерастворимых носителей используют нерастворимые носители полимерной природы либо неорганическиекремнийсодержащие носители.П р и м е р 1 (сравнительный).Реактив: 1 10- М раствор Ь-лейцинп-нитроанилида в 0,1 М фосфатномбуфере рН 6,90 (25, 1 мг в 100 мл).Навеску анализируемого носителя0,100 г (м = 0,100 г) контактируютв 5 колбочках с 40 мл раствора реактива 19 ч. После этого носитель сосвязанным п-нитроанилидом отделяютсепарацией и промывают на вакуумфильтре до полного отсутствия пнитроанилида в промывном растворе.Отсутствие его в промывном раствореконтролируют определением после гидролиза 1 М,ИаОН. Промытый носительсо связанным реактивом суспендируют в 10 мл. воды, переносят в мерныеколбы на 100 мл, добавляют б мл1 М ИаОН и гидролизуют 30 мин при60 С в термостатируемой водяной бане.Потом охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют 1 М раствором35НС 1 до рН 7, доводят колбу до меткифосфатным буфером, перемешивают и измеряют оптическую плотность растворапри 405 нм, относительно буферногораствора,Параллельно проводят контрольна гидролиз полимера, Также берутнавеску (0,100 г) самого полимера(без связанного п-нитроанилида) ипроводят те же операции.45Содержание альдегидных групп .рассчитывают по формуле(Р -Э )ч 10С = - ф ----- ,м Е 1000 50где Э, - средняя оптическая плотность (из пяти параллельныхопределений) гидролиэатаполимера с альдегидными груп-пами;55Э - оптическая плотность гидро-клизата самого полимера (без,связанного и-нитроанилида); ч - объем мерной колбы для гидролизата, мл;м - масса навески полимера, г;Е - коэффициент молярногосветопоглощения при 405 нм(Е=9,62 10, согласно известному способу)При м 0,100 г; ч 100 мл; Е 9,62ю 10М см(согласно известномуспособу); 0 - 0,212; П 0,020;С=20,0 мкмоль/г.Относительное стандартное отклонение (п=5) +ЗХ.Пример 2. Реактив: 4 10Мраствор Ь-лейцин-п-нитроанилида в0,1 М фосфатном буфере рН 6,90 (25 мгв 25 мл),Шесть навесок полимерного носителя по О, 100 г каждую (м=0, 100 г) переносят в колбочки для проведенияконтактирования. К одной добавляют5 мл О, 1 М фосфатного буферного раствора, а к другим по 5 мл растворареактива, Колбочки закрывают пробками, перемешивают и оставляют дляконтактирования в темном месте на19 ч. После этого контактные растворы с реактивом и сам реактив доводят до 50-кратного разбавления буферным раствором, измеряют оптическую плотность при 310 нм.При м 0,100 г; П 0,30; Оо 1,04;Э 0,933; и 50; М = 251,3. Содержаниеальдегидных групп С=20,6 мкмоль/г.Молярный коэффициент светопоглощения, выражающий чувствительность,рассчитывают по формулеЕс егде с - молярная концентрация раствора,м 1000чпМ Е = 1310.Относительное стандартное откло"нение (и = 5) + 1,5 Х.Определение концентрации.п-нитроанилида по оптической плотности при310 нм возможно в условиях их линейной связи, что иллюстрируется даннымитабл, 1,Влияние температуры на результатыанализа Функциональных групп альдегидсилохромов и бензохинонсилохромовприведено в табл, 2,Данные по примерам приведены втабл.З,.сопоставительные данные, до9 мкмоль/Г где и б ш Таблина 1 Пример мкг/мл моль/л 2,50 10 4,18 10 5,49 10 5,89 10 7,52 10 1 6,28 2 10,5 3 13,8 4 14,7 5 18,9 12,65 10 12, 7 10 13,010 12 8. 10 э 12,8 10 0,316 0,531 О, 713 0,748 0,963 Табли ца 2 Пример Кол-вофункц.групп,мкмоль Объект исследования Функциональные Темперагруппы тура инкубации,С Времяинкубации, ч1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Бензохинонсилохром5 1509111казывающие преимущества предлагаемогоспособа - в табл. 4. Формула и з обретенияСпособ количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот1 О функциональных групп на нерастворимых носителях путем обработки носителя раствором пара-нитроанилида аминокислоты, последующего спектрофотометрического определения продукта реакции15 и расчета количества реакционноспособных групп, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, обработку носителя пара-нитроанилидом аминокислоты проводят в течение 2-20 ч при 10-60 С, спектрофотометрирование осуществляют при длине волны % =310 нм, а расчет количества функциональных групп С проводят по формуле Концентрация раствора(п П,+В)-п В) ч и,106Мп Рч н- кратность разбавления раст-.вора реактива до и послеобработки носителя; - оптическая плотность разбавленного раствора реактива;оптическая плотность буферного раствора после обработки носителя;оптическая плотность разбавленного раствора реактивапосле обработки носителя; - объем реактива, взятого дляконтактирования с носителем,МП е- масса навески реактива, г; - масса навески анализируемогонерастворимого носителя, г; - объем мерной колбы, взятойдля приготовления растворареактива, мл;- молекулярная масса п-нитроанилида аминокислоты.1509111 Продолжение табл 2 Времяинкубации, ч Пример емпераура инубации, С Н45 40 34 60 65 65 12 13 14 10220 Таблица 3 Бремяреакциии-нитроанилнда,Реакционно-способная группа и еесодерханиемкмоль/г Пример Нераствориныйноситель 7Кол-во нм рункцио- нальных Т проведения анапиФ .эа, С п-Нитроанилидаминокислоты Точность он ределения(коитрольньн 113 (контрольный14 (контрольный1516 Объакт исследования ФункциональныегруппыСилохромПолимерПолимер 810182022 Кол-во функц. групп, мкмоль 20 б17,3211620,948,677,0120,0130,08,1+1,52 полярность раствора реактива ИКоличество носителя, взятоедля анализа, м, гКоличество реактива, взятоедля инкубации, млВремя инкубации, чКоличество и продолжительность операции после инкубации: Коэффициент молярного светопоглощения, выражающий чувствительность анализа Относительное стандартноеотклонение, выражающее точность определения (п=5) Отделение носителясепарацией (10 мин) Промывание носителяна вакуумфильтре(5 мин) Суспендирование носителя водой и перенос в мерные колбы (5 ьщн) Добавление раствораИаОН (2 мин) Гидролиз при 60 С(30 мин) Охлаждение до комнатной температуры(5 мин) Нейтрализация кисло.той (5 мин) Разбавление буфернымраствором до метки(5 мин) Табли ца 4 Разбавление растворареактива (5 мин) Разбавление растворапосле инкубации