Способ качественного определения смеси желчных кислот и их комплексов с таурином и глицерином

ИБ,ц 440600 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ союз Советских Социалистических Республик(51) М. Кл. 6 01 п 31/08 ГещдеретееищЭ иеввитетСовета 1 йииистрев СССРие делам иэебретеиийи открытий(72) Автор изобретения Я. И, Карбач Винницкий медицинский институт им. Н, И. Пирогова(54) СПОСОБ КАЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СМЕСИ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ТАУРИНОМ И ГЛИЦИНОМ1Изобретенис касается аналитической химии желчных кислот и относится к способам качественного анализа их смесей.Известен способ качественного анализа смесей желчных кислот и их комплексов с глицином и таурином путем хроматизирования на бумаге анализируемой пробы с последующим проявлением хроматограмм и идентификацией компонентов смеси по величинам. Полный анализ смеси, кислот требует применения нескольких систем подвижных растворителей, например холевая, дезоклихолевая и гиодезоксихолевая кислоты и их комплексы хроматографируются в системе дихлорэтан гептан (60:40 - 70:30), тауриновые производные хроматограф ируются в системе ди хлорэтанбутанол (85: 5) и т. д.Полное время анализа до 48 часов. Таким образом, известный способ характеризуется длительностью анализа и его сложностью изза необходимости применения нескольких систем подвижных растворителей.Цель предлагаемого способа - ускорить и упростить анализ смеси желчных кислот и их комплексов с таурином и глицином.Это достигается тем, что в качестве растворителей используют смесь ледяная уксусная кислота - муравьиная кислота - гептан;Кроме того, указанную смесь растворителей рекомендуется использовать в следующих объемных соотношениях; толуол - 3 - 4 об. части,ледяная уксусная кислота - 2,3 - 3,5 об, части,85% -ная муравьиная кислота - 0,3 - 0,5 об.части и гептан - 2,3 - 3,2 об. части.5 П р и м е р. На хроматографическую бумагунаносят очищенную от липидов жирных кислот, белков и желчных пигментов анализируемую желчь.Очистку образца желчи проводят таким об 10 разом, что на хроматографическую бумагу,предварительно обработанную хлористым барием и высушенную, наносят исследуемую пробу, высушивают и последовательно обрабатывают бумагу с нанесенной пробой диэтиловым15 эфиром и этиловым спиртом,Желчь разводят вдвое 0,02 н, раствором гидроокиси натрия и 0,06 - 0,03 мл наносят нацентр хроматографической бумаги размеромЗОХ 40 мм, одна из коротких сторон которой20 срезана в виде заостренного клина, высушивают и бумажку вставляют в аппарат для экстракции, состоящий из приемника (стекляннаяпробирка размером 15 - 20 ммК 150 мм), воздушного холодильника (стеклянная трубочка25 размером 10 - 13 мм)(500 мм) и соединенныхмежду собой при помощи шлифа. Бумажку спробой сворачивают в форме цилиндра и на1/5 ее длины и вставляют заостренным концомнаружу в шлиф воздушного холодильника,зо В приемник наливают 2 - 2,5 мл диэтиловогоЯЯ и/и Кислота О 13 0,20 0,25 0,28 0,41 0,51 0,56 0,62 0,70 0,79 0,92 ТаурохолеваяТаурохенодезоксихолеваяТауродезоксихолеваяТауродитохолеваяГликохолеваяГликозенодезоксихолеваяГликодезоксихолеваяХолеваяХенодезоксихолеваяДезоксихолеваяЛитохолевая 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 35 40 45 50 55 60 эфира, свободного от этилового спирта и перекисей, соединяют с воздушным холодильником, в просвет которого вставлена бумажка с нанесенной пробой, и экстрагируют в течение 10 минут на водяной бане при температуре 50 - 60. Время экстракции отсчитывают с того момента, когда эфир начнет канать с клиновидно заостренного конца бумаги.После экстракции эфиром меняют приемник на новый, в который наливают 1 мл 96 этилового спирта, соединяют приемник с воздушным холодильником (с оставшейся в нем бумажкой экстрагированной эфиром) и ведут экстракцию на кипящей водяной бане этанолом в течение 15 мии., считая с момента, когда спирт начнет капать с бумажки.После окончания экстракции спиртом трубку воздушного холодильника вместе со вставленной в него бумажкой отсоединяют от приемника, а. имеющийся в приемнике спирт выпаривают досуха на кипящей водяной бане.Оставшийся после выпаривания сухой остаток используют для нанесения на хроматографическую бумагу. С этой целью сухой остаток растворяют в 0,2 - 0,4 мл н-бутилового спирта и наносят на бумагу около 0,05 - 0,03 мл, высушивают, места-. нанесения и хроматографируют согласно указаниям, описанным ниже.Хроматографическую бумагу разрезают вдоль волокон на плоскости шириной 30 мм и длиной 300 мм. На одном конце бумажной полоски карандашом чертят трапецию, нижнее основание которой равно ЗО мм (ширина полоски), высота - 25 мм, а верхнее основание составляет 6 мм и переходит в полоску длиной 15.мм, которая затем на протяжении 25 мм постепенно конусообразно расширяется до 300,мм, (ширина полоски).После этого бумажные полоски замачивают в 0,05 н, растворе трилона Б, высушивают при 90 и. путем нисходящей хроматографии (в лодочку вставляют размеченный конец бумаги) промывают в течение 36 - 48 час, 0,1 н. раствором аммиака, Затем бумагу сушат и промывают таким же способом в течение 48 часов смесью, состоящей из 3 частей бутана и 1 части уксусной ледяной кислоты, сушат под вытяжным шкафом до полного исчезновения запаха уксусной кислоты и сохраняют в сухом, защищенном, от пыли, месте. Перед хроматографией бумагу вырезают соответственно ранее сделанным разметкам, 20 мин, сушат при 105 С и затем наносят исследуемую пробу на образовавшийся перешеек в точку, расположенную в 5 мм от верхнего основания трапеции,Хроматографирование ведут восходящим путем, в 250 мл мерных цилиндрах, закрытых обернутой в полиэтиленовую пленку резиновой пробкой ( 36), На дно цилиндров налита подвижная смесь в количестве 7 - 10 мл, которую используют, многократно (хроматографируют 6 - 7 раз) и в течение недели она полностью сохраняет свои свойства. Для быстрого насыщения пространства камеры (цилиндра) парами подвижной фазы его закрывают пробкой и смачивают внутренние стенки налитой на дно смесью растворителей. После этого полоску бумаги с нанесенной пробой прикрепляют согнутой в крючок булавкой или скрепкой к резиновой пробке, обернутой полиэтиленовой пленкой, погружают на 2 - 3. мм в раствори- тель и герметически закрывают цилиндр при помощи той же пробки и лейкопластыря. Хроматографирование ведут при комнатной температуре дважды. После каждого хроматографирования бумагу высушивают 5 мин. при 105 С. Длительность одноразового хроматографирования равна примерно 6 - 7 час., при подъеме подвижной фазы на высоту в 225 мм от места нанесения пробы, После повторного хроматографирования сухую хроматограмму проводят через насыщенный хлороформенный раствор треххлористой сурьмы, нагревают 5 минут при 100 - 105 и пятна желчных кислот рассматривают в ультрафиолетовом свете, проходящем через фильтр Вуда. Коэффициенты при использовании предлагаемого состава подвижной фазы и нанесении на хроматограм,му по 25 мкг отдельной желчной кислоты были следующими: Указанным способом можно разделить 5 -150 мкг каждой кислоты. Предмет изобретения1. Способ качественного определения смеси желчных кислот и их комплексов с таурином и глицином путем нанесения анализируемой пробы на хроматографическую бумагу с последующим хроматографированием в системе лодвижных растворителей и идентификацией компонентов смеси обычным образом, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения анализа, в качестве растворителей используют смесь ледяная уксусная кислота - муравьиная кислота - гептан.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что вышеуказанную смесь растворителей используют в следующих объемных соотношениях; толуол 3 - 4 об. части, ледяная уксусная кислота - 2,5 - 3,5 об, части, 857 О-ная муравьиная кислота 0,3 - 0,5 об. части и гептан - 2,3 - 3,2 об части,