Способ культивирования бактерий воrdетеllа реrтussis

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 6 ОБР Я ИОАН ПАТЕНТ о ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(72) Едзи Суэуки, Ацуси Имайзуми,Хисао Ямагути, Масахару Канесаки иСодзи Оно (,1 Р)(,56) Я 1 апег 13.У., Бсйо 11 е М,Ю. Аяшр 1 е СЬешса 1 у ВеГпес 1 Мейша 1 ог1 Ье Ргойцс 1 оп оГ Рйаяе 1 Вогйе 1 е 13.рег 1 ияяЫ. - Ю. оГ яепега 1 Мз.сгоЬо1 оцу, 1971, ч,63, р.211-220.(54) СПОСОБ КУЛЪТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИИВОЖЕТЕЬЬА РЕБТОББ 1 Б(57) Изобретение относится к медицинской микрсбиологии и может бытьиспользовано для накопления биомас 2 И 1/20// (С 12 Б 1/2 В 1:01) сы коклюшных бактерий в 1-й фазе. Цель изобретения - снижение посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, а также стимулирование роста микроорганизмов Суспензию бактерий Вогйе 1 е 11 а рег цяяЫ в 1-й Фазе выращивают в плотной или жидкой питательной среде Штайнера-Шольте, дополнительно содержащей производные Ы -или а -цикл декстринов в концентрации 15000 мгк/мл среды. Посевы инкубируют при 30-38 С в стационарных или погруженных аэробных условиях.При этом можно получить рост при посевной дозе О кл./мл. Для дополнительной стимуляции роста в состав среды вводят казаминокислоты в количестве 0,5-10 мг/мл среды. На плотной среде диаметр колоний составляет 1,0 -1,2 мм. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомассыкоклюшных бактерий.Цель изобретения - снижение посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, атакже стимулирование роста микроорганизмов 10Способ осуществляют следующим образом.Питательную среду Штайнера-Шольте (ШШ) готовят путем добавления дополнительного раствора, который получают стерилизацией с использованием миллипорового Фильтра (0,45 мкм)из водного раствора, содержацего,г:1-цистеин 4; сульфат двухвалентногожелеза 1; аскорбиновая кислота 2: 20никотиновая кислота 0,4; глютатионвосстановленного типа на 1 л раствора в концентрацииоб.к основнойсреде 10. Основную среду получаютпутем приготовления водного раствора, содержацего, г; глютамат натрия 10,7, 3.-пролин 0,24; хлористыйнатрий 2,5; дигидрофосфат калия 0,5;хлористый калий 0,2; хлористый магний О,1; хлористый кальций 0,02; трисоксиметиламинометан на 1 л раствора 1,525, значение рН доводят до7,6, затем стерилиэуют в автоклавеи,при 21 С в течение 15 мин, В зависимости от концентрации микроорганизмов в среду вводят соответствующиеколичества циклодекстрина ( ЦЦ) илиего производной.Для усиления роста микроорганизмов наиболее предпочтительным вариантом среды является питательная средаШШ с 0,5-10 г/л казаминокислот.Для вырацивания культуры можноиспользовать известные способы и условия. Однако выращивание при встряхивании является предпочтительным,и его желательно проводить при 30 -38 С в течение 10-100 ч.ВогйеСе 11 а регСияяхя 1-й фазыоштамм Тохама вырацивают при 35 С насреде ШШ, содержащей метил-а-циклодекстрин, в течение 48 ч. Надосадочную жидкость (рН 8,3), полученнуюцентрифугированием культуральной жидкости, подают на колонку с оксиапатитом, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером (рН 8,0), Раствор,выходящий из колонки, подкисляют дорН 6,0 и вновь подают на колонку с оксиапатитом, уравновешенную 0,01 Мфосфатным буфером (рН 6,0), и затемэлюируют связанный белок 0,1 М ФосФатным буфером (рН 7,0), содержащим0,5 М БаС 1, Полученный элюат подвергают аффинной хроматографии, используя гаптоглобин-сефароэу 4 В, и затемэлюируют целевой продукт 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 0,5 М БаС 1 и 3 М тиоцианата калия.Нитевидный гемагглютинин получаютпосредством элюирования связанногобелка в колонке с оксиапатитом (рН8,0) 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0),содержащим 0,5 М БаС 1, и очицают методом аффинной хроматографии на гаптоглобулин-сефароэе 4 В,1 р и м е р 1. Лиофилизированнуюкультуру ВогйеСе 11 а регСияяя штаммТохама 1-й Фазы суспендируют в1 -ном растворе казаминокислоты изатем выращивают на среде Борде-Генгона (БГ), содержащей 20% лошадиной крови, иэ которой удален белок,при 35 С в течение 3 сут. Одну полную петлю с культурой растущих клеток стимулируют на среде БГ в течение 24 ч и суспендируют в среде ШШ.Получают суспенэию концентрациейклеток 5 10 кл./мл.Плотную среду ШШ с плотностью агара 1,2 , содержацую ЦЦ или его. производную, наносят на пластины, затем распыляют микробную суспензиюдо содержания 10 клеток на однупластину.Результаты роста бактерий (числоколоний) после четырехсуточногоинкубирования при 35 ОС представленыв табл.1.П р и м е р 2, Суспенэию для ино,кулирования, полученную по примеру1,инокулируют в 1 млжидкой среды ШШ, содержащей метил-р-ЦЦ при числе клеток 10 , и инкубируют при 35 С в Ь- пробирке Монода с возвратно-поступательным встряхиванием.Результаты влияния концентрации метил-р-ЦЦ на мутность среды с культурой в зависимости от времени инку Ъ баций"приведены в табл.2. Из табл. 2 следует,. что при добавлении метил-р-ЦЦ в среду в количестве от 1 до 500 мкг/мл степень помутнения среды воэврастает пропорционально количеству ЦЦ, что свидетель1384206 40 Таблица 10 О с 10 О с 10 О с 10 10-100 00-500 0-100 00 и 0-.00 .10-00 00-500 00-50 ствует о промотировании роста микробов,П р и м е р 3. Готовят плотную среду ШШ, при этом увеличивают концентрацию глютатиона восстановленного типа в 1,5 раза по сравнению с известной прописьюсреды, и добавляют различные концентрации казаминокислот и метилЦЦ. На каждую пласти О ну со средой высевают 1 О клеток ВогсеСе 11 а регСияя я 1-й фазы штамм Тохама и выращивают 3 дня при 35 С.Результаты влияния казаминокислот и метилЦЦ на рост бактерий 15 ВогйеСе 11 а регСыяя.я приведены в табл.З. Из данных табл.3 следует, что в отсутствии добавок на среде ШШ при 20 посевной дозе О кл./мл рост отсутствует, в то время как при добавлении метил-в-Щ в интервале 500 - 1000 мкг/мл количество колоний возрастает, а при добавлении каэамино кислоты в количестве от 500 до 5000 мкг/мл размер колоний увеличивается и их легко наблюдать (1,0 - 1,2 мм по сравнению с 0,8 мм в контроле) .30П .р и м е р 4. Жидкую среду ШШ усовершенствованного типа готовят путем добавления каэаминокислоты в количестве 1 О мг/мл. Увеличивают концентрацию глютатиона в 1,5 раза и в 20 раэ концентрацию аскорбиновой кислоты и используют в количестве 1 об.% от основной среды. Метил-р-ЦЦ добавляют в соответствующие пробы среды в количествах от 50 до 5000 мкг/мл, Приготовление пробы сред разливают по 200 мл в колбы Сакагучи, Каждую порцию среды инокулируют суспензией бактерий при концентрации клеток 1,5 10 кл,/мл и 45 инкубируют.Полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление производного ПД в культуральную среду в количестве от 50 до 2000 мкг/мл в присутствии казаминокислоты усиливает рост клеток ВогйеСе 11 а регСияя 2 я еИспользование циклодекстринов позволяет повысить ростовые свойства среды, что в свою очередь позволяет снизить посевную дозу инокулята,стабилизировать процесс культивирования, а добавление каэаминокислот - получать более пышный рост бактерий,форм ула изобретения 1. Способ культивирования бактерий ВогйеСе 11 а регСияяя в -й фазе на/или в питательной среде Штайнера-Иольте, содержащей источники углерода, азота, набор минеральных солей, аминокислот и витаминов, в стационарных или погруженных аэробных условиях при 30-38 С, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью снижения посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, культивирование осуществляют в присутствии гексакис-(2,6-о-диметил)-Ы-циклодекстрина или гептакис- (2,6-о-диметил)-р-циклодекстрина в концентрации 1 - 5000 мкг/мл питательной среды.2. Способ по п,1, о т л н ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью стимулирования роста микроорганизмов, в питательную среду дополнительно вводят казаминокислоты, при этом в плотный вариант среды добавляют 0,5 - 10 мг/кл среды каэаминокислот при концентрации гексакис-(2,б-о-диметил)-Ы-циклодекстрина или гексакис- (2,6-о-диметил)-р-циклодекстрина 250-000 мкг/мл среды, а в жидкий вариант среды казаминокислоты добавляют в концентрации 5-20 мг/мл среды при концентрации циклодекстрина 50 - 2000 мкг/мл среды.1 00 500-1000 00-5006 Продолжение табл.1 384206 нцентрации микроорганизмов среды, мкг/мл 1000 2500 5000 с 10 с 10 10-100 100-50000-500 500-1000 500-1000 100-500 0-100 етил-а-ЦЦ 0-100 100-500 100-500 с 10 О0-100 0-00 с 1 с 10 4 Ф0 сО 10 10-100 100-50 100-5 етил6-о-диметил)-Ы,6-о-диметил) в рм е ч а н и е. Ы-метилциклодекстрциклодекстрин - ме циклодекстрин - ме 2 650 мм утнения среды (Очерез, ч епень ОО 0,490,695 О 54 7 О,О 0,4 3 ОО ица Соде и ло мк 09 О с 10 с 10 онцен ацияЦД,мкг 016 007.0 Составитель Г.СмирноваТехред М.Дидык Корректор О,Кундрик Редактор Н.Тупица Заказ 1357/58 Тираж 520 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 0 0 0 0 ФКолонии относительно малого размера.1 99 121102 137 0 74