Способ подготовки лигноцеллюлозосодержащего материала для определения в нем белка

9 1)5 ОО СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСПГЧЕСКИХ РЕСПУБЛ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЩОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)ОПИСАНИЕ И НИ И АВТОРСКОМУ СВИДЕПИЬСТВУ(72) Шульга АВБрустовецкая ТП.т 54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖЯЩЕГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В НЕМ БЕЛКА57,15 Изобретение относится к области микрОбиалогии, биотехнолоГии, биохимии и касается определения белка в растительномматериале и культурах микроооганизмов,выращенных на средах с лигноцеллюлоз-ным субстратом,ЗначительнуО трудность представляетопределение белка в таких сгОжных биогОгических субстратах, как лигноцолглолазосодержащие 14 атериапы (опилки, солома,гузапая, торФ и т,д.) и микробная биомасса.выращенная на таких материалас, и содвржащая неутигИзированные целлОЛОЗу, ллгнин и продукты х разложения,В таких случаях особе 14 Г важна пГЗед.варительная подготовка биологического мв"териала.г,1 ельО изобретенЯ Являетсг повышение степени очистки пробы и тем самымповышение Точности определения в нейбелка,При обработке лигнацеллголозиого материала предлагаемым способам обеспечивается Отделеие белка ат нерастворигГэгалигноцеллголозного субстрата, мотергалаклеточных станок и других кислТонерастВоримых полисахаридов за счет использаванииг зкстракции белков санцентрироввнным растворам трихларуксуснсй кислоты г",ТХУ),При Всстрвкции белков концентрированным растворам ТКУ Однавремен 1 О врзствар гереходят нуклеино 1 эьге кислот 1прадукты иу, гидролиза и другие изкамЛесулярные азотистые веществе. Последугоц 188 разбавление смеси дистиллированойводой 8 3-6 раза (до кющентрзпии ТХУ врастворе ОЯ,2 М) приводит к осаждени обелка в вещества содер)кащиг небелгсовыйазот гнуклеиновые кислоты и продукты ИХгидралчза), ОстаОтся в растворе. Таким Образом осадок которы, испол яуе Гся д 111дальнейшего определения белка, содеркитЛИЦЭЬ НЕЗНаЧИтЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО ЛИГНИГ идругих сагутствугащих гримесей, что позволяотто 1 но Определить содержание в пробахггигиоце 1 лгалозосодерсащегсг материалоистиннОГО белка метОдами, используемымидля массового анализа, а именно по коли гвству общего азота и с помощ 1 О кумасси 825 О.Был проведен поиск оптимальных параметров обработки лигОцеллгоггозосодермсащего материала для сохранения точностиметода определения белка, зкстрагируемого из этого материала, за истинное содержание белка в пробе лигноцеллюлозосодержащего материала принималось гсличество белка, определенное пс суммеамина(исло при аминосисгатном анализе Б 10 1 Г 1 ф 0 25 30 35 40 с обработкой материала Го способу-прототипу,Определение содеркаИЯ бела биомассы гриба Р 11 ОИота тцбегсц 1 оза 151, выращон ного на Опилс 1 м, в зависимости от конеггграцигл ТХУ для зкстракции белка и времени зкстракции показало, что Область ОпГимзльных пвраметаов для зкстаакции бе 1 ка 18 ходлтся в эгэйане 5 м ТХУ и 3 мин зкстрасции. "1 ри уманьцении взятых интервалов были определены границы атой области от 4,5,с 1 О 5,5 М ТХУ и время экстракции От 2,5 до 3,5 мин (табл. 1).Дя г 1 оиска Оптимальных параготрав разведения 1 ХУ - экстракта для Осаждения белка была исследована Область От 0,5 М до 1, э Й 1 1,с интервалом 0,1 Ь 1.Из ггредставлв 1 гх в табл,2 данных определяли аптимальнуа область разведения 1 Х-зкгтоактч(ОТ 09 Л да 12 М)Способ паг 1 сняетсгя следующими примеааю.гиНО всех примерах прлведены также реЗультбты Определения белка в аналогичньгх проых с испальзогэанием в качестве контроля известых способов Обработки гробы и изглерениЯ к(11 ичестгэ балка, эо всех таблицах поиведены средние значения из трех 1 иоалггельых ОпреселеггиЙ,П р и м е р 1, 1-авеску измельченной пшеничной СОтОмиги ОГгилак 100 мГ звливагот 2 мл Б 11 Л раствора трихлоруксусной кислоты и выдерж 1 ваОт 1 а кигящей водя- но, айаге в те гение 3 мин, Пообу центрифуГируОт 10 мин при 5000 сг и ст)ернатат разаавяягот холаднОЙ дистиллирОванной ВОДОгт ДО КОНЕЧН,1 й КОНЦЕНТРаЦИИ тРИХЛО- руксусной кислотьг 1 М, ахлаждагот в течение 18 мин в ледяной бане и це ггрифугируОт при 10000 а 10 мин. Содержание белка ог;редвлгпот с помощью реактива кумасси и по содержанига общего азота Результаты предс-авлены в табл, 3, П р л м е р 2, Нагеску биомассы гриба РйоОа гцЬегсцгоза 151, выращенного на березовых ОГ 1 илкох, сгбрабатывагот способом, Описанным в примере 1, но выдерживагот пробу в 4,5 М трихлоруксусной кислоте в течение 2,5 млн на кипящей водяной бане, а супсрнатант Ггосле 1-го центриугироваНИЯ )ЭзбЗВ 1 ггОГ дистиплиоованной водой до конечной гсонцентрации ТХУ 0,9 М,Резул ьтаты 11 ри веден ы в табл, 4, 11 р и м в р 3, Навеску биомассы Грлба ДСГЕГЛОПОП 1 Зр, бл 02 С, ВЫращЕННОГО На пвэеи Ной соломе, Обрабатывают способом, описанным в примере 1, но пробу выдерживагог в 5,5 М ТХУ в течение 3,5 мин. а1267900 Таблица 1 Содержание белка биомассы гриба РюПо 1 а тоЬегсооза 151, выращенного на опилках, в зависимости от концентрации ТХУ для зкстракции белка и времени зкстракции(содержание белка в данной биомассе при определении по сумме аминокислот 3,01Таб Содержание белка биомассы гриба РпоИо 1 а шЬегсоова выращенного на опилках, в зависимости от ра: правлен ТХУ -зкстракта дистиллированной вод,й абл Содержание белка в зосодержащем матер лении предлагаемы способами (содерж сумме аминокислот: в опилках -лигноцеллалоиале при опредем и известным ание белка по в соломе 0,95, 0,49) Спо работк 1 эмер белк,цем а супернатант после 1-го центрифугированияразбавлиот дистиллированной водой до конечной концентрации ТХУ 1,2 М,Результаты приведены в табл, 5. 5 Таким образом, предлагаемый способ предварительной обработки лигноцеллюлозосодержащего материала для определения в нем белка позволяет повысить 10 точность наиболее быстрых широко применяемых в серийных и единичных анализах методов, т,е. довести ее до уровня, получаемого при использовании наиболее точного из всех известных методов количественного определения белка. 56) Термхитарова Н, ГШульга Р., В,Прикладная биохимия и микробиология,1974, т, 10, Я б, с. 928.1267900 СоставительРедактор Н,Тимонина Техред М,Моргентал Корректор Л.Филь Заказ 3333 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж.35, Раушская наб 4 й Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Формула изобретенияСПОСОБ ПОДГОТОВКИ ЛИГНОЦЕЛЛВЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО . МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 8 НЕМ БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы и нагревание ее в. растворе трихлоруксусной кислоты на кипящей водяной бане с после: дующим центриФугированием и выделением супернатанта, отличающийся тем, что, сцелью повышения степени очистки пробы и тем самым повышения точности определения в ней белка, концентрацию раствора трихлоруксусной кислоты выбирают в пределах 4,5 - 5,5 М. нагревание ведут в течение 2,5 - 3,5 мин и выделенный при центрифугировании супврнатант разбавляют дистиллированной водой до конечной концентрации трихлоруксусной кислоты 0,9 - 1,2 М с последующим повторным цен трифугированием для выделения белоксо-.держащего осадка.