Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 751 вЯ 51) 4 С 01 М 33/4 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ГОСУДАРСТВЕНКЫИ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕКИЙ И ОТКРЫТИИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) В 1 ггег Т., Мцдг Н.М. А шооИе цгопс асЫ сагЬаво 1 е геаСгдоп. Апа ВосЬеш.,1962, В 4, р,330-334.СговвяеЬацег К., КПррег Э, 1 пгегасгоп ЬеЫееп 0 ИА-Ьпд 1 п 8 21 цогосЬ- гошев апй шцсоро 1 увассЬагЫев п абрагове й 1 Нцв 1 оп гревс. К 11 п ИосЬепзсЬг 1981, ч. 59, У 18, р. 1065- 1066.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ(57) Изобретение относится к биологической химии, Цель изобретения - повышение чувствительности способа исокращение времени анализа. Измеряютфлюоресценцию раствора 4,6-диамидино-фенилиндола, Добавляют исследуемую пробу. Измеряют флюоресценциюсмеси после каждого добавления пробы,При рН 5,6-6,0 регистрируют снижениеинтенсивности флюоресценции, по кото.рому рассчитывают общее содержаниегликозаминогликанов. При рН 2,0регистрируют повышение интенсивностифлюоресценции, по которому рассчитывают содержание гепарансульфата,7 табл.,9 0,86 0,З = З90 Изобретение относится к биологической химии, а именно к количественному определению гликоэаминогликанов, и может быть использовано влабораторно-клинических и экспериментальных исследованиях.Цель изобретения - повышение чувствительности способа и сокращениевремени анализа за счет измеренияинтенсивности флюоресценции раствора 104,6-диамидино-фенилиндола при добавлении исследуемых проб при определенных значениях рН.Способ осуществляется следующимобразом. 15Измеряют флюоресценцию раствора4,6-диамидино-фенилиндола (ДАФИ),затем добавляют исследуемую пробуи измеряют флюоресценцию смеси послекаждого добавления пробы. При рН 205,6-6,0 регистрируют снижение интенсивности флюоресценции, по которомурассчитывают общее содержание гликозаминогликанов (ГАГ), при рН 2,0регистрируют повышение интенсивности флюоресценции, по которому рассчигывают содержание гепарансульфата (ГС),П р и м е р 1. Определение суммарного содержания ГАГ в моче.Для определения берут О, 1 мл отдиализованной в течение ночи мочии 2 мп водного раствора ДАФИ в концентрации 516 М с рН 5,6,В кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см вносят 2 мл водного раствора ДАФИ и измеряют наспектрофлюориметре при длине волны450 нм (длина волны возбуждения 355 нм) интенсивность флюореспенции.Уровень флюоресценции водного раствора ДАФИ Рц выставляют на шкалеприбора как 1007, (см. табл. 1) . Затем микрошприцем в кювету вносят5 мкл тестируемого образца мочи иснова определяют интенсивность флюоресценции Р. Процедуру внесения 5 мклтого же образца мочи с последующейрегистрацией Р повторяют еще дважды.Результаты измерения изображают графически на масштабной бумаге в коор"динатах Р/Р и объем мочи. По графику определяют тангенс угла наклона Мначальной части кривой к оси ординат,который равен значению, отсекаемомукасательной к кривой на оси абсцисс. Аналогично строят калибровочнуюкривую для стандартных растворовхондроитинсульфата в координатах:величина, обратная концентрации ГЛГ,1257519 4Продолжение табл.2 3 ( 4 10 0,80 15 0,4 = 2,5 0,86 10 0,72 0,68 15 36 Г 0,5 = 2,0 0,83 0,65 Таблица 3 1,00 0,94 0,88 0,85 Затем по калибровочной кривой находят соответствующую определенному ,. тангенсу угла наклона обратную концентрацию ГАГ. Концентрацию ГАГ в образ це мочи рассчитывают по формуле 25ГАГ 11ГАГ 1При тангенсе угла о 6, равном в данном случае 44, обратная концентрация ГАГ составляет 2,9 мл/мгКонцентрацию ГАГ в данном образце рассчитывают следующим образом: 1(ГАГ = --- = 0,345 мг/мл.2,9 мл/мгП р и м е р 2. Определение суммар ного содержания ГАГ в растворе протеогликанов.Для определения берут О, 1 мл водного раствора протеогликана в концентрации 0,2 мг/мл и 2 мл водного 40 раствора ДАФИ в концентрации 5 1 О М с рН 6,0.В кварцевую кювету вносят 2 мл водного раствора ДАФИ и исходный уровень флюоресценции Р выставляют 45 на шкале прибора как 100%, Затем в кювету с раствором ДАФИ вносят микрошприцем 5 мкл раствора протеогликана, содержащего ГАГ, и определяют интенсивность флюоресценции 50 (табл. 3) . Процедуру внесения 5 мкл раствора протеогликана с последующей регистрациейинтенсивности флюоресценции повторяют еще дважды. Результа-ты, приведенные в табл. 3, изобража ют графически на масштабной бумаге в координатах Г/Гд - объем раствора протеогликана, Затем определяют по касательной к кривой тачгенс угланаклона кривой к оси ординат (Т 8 М ),и по калибровочной кривой определяютконцентрацию ГАГ в водном растворепротеогликана. Объем раствора, вносимого в кювету, мкл Для данного образца Сд Ы .составил 84. Это соответствует по калибровочной кривой обратной концентрации ГАГ 15, 56 мл/мг. ГАГ 15,56 мг/мл= 0,18 мг/мл, т.е. в исследованном препарате протеогликана (концентрация 0,2 мг/мл) содержание ГАГ состав ляет 90% (О, 18 мг/мл).П р и и е р 3. Определение суммар. ного содержания ГАГ в амниотической жидкости.Для определения берут О, 1 мл отдиализованной в течение ночи амнистической жидкости и 2 мл водного раствора ДАФИ в концентрации 5 10 М с рН 5,8,В кварцевую кювету вносят 2 мл водного раствора ДАФИ и исходный1257519 Таблица 6 Концентрация ГС (мг/мл) 0,2 7,2 0,3 10,8 14,4 0,4 Таблица 4 0,5 18,0 0,6 0,7 21,6 25,2 20 1,00 28,8 0,8 0,95 10 0,89 25 0,84 15 20 0,81 30 Таблица 7 Объем раствора, мкл,вносимый в кювету Таблица 5 100 Объем мочи, вносимый в кювету, мкл Р дР=Р - Р 20 109 100 20 108 уровень флюоресценции Р выставляютна шкале прибора как 100%, Затемв кювету с раствором ДЛФИ вносятмикрошлрицем по 5 мкл тестируемогообразца амниотнческой жидкости и оп"ределяют интенсивность флюоресценции(табл. 4), Результаты измерения изображают графически на масштабной бумаге в координатах Р/Г " объем амниотической жидкости, определяют тан- Огенс угла наклона начальной частикривой к оси ординат (С 8 с 6), и по калибровочной кривой определяют концентрацию ГАГ в амниотической жидкости 15 Объем раствора, вносимого в кювету, мкл При тангенсе угла Ы , равном для данного образца 95, обратная концентрация ГАГ составляет 6,3 мл/мг.1ГАГ = --- - -- = 0,159 мг/мл 356,3 мл(мг П р и м е р 4. Определение концен. трации гепарансульфата в смеси ГАГ в моче.Для определения берут О, 1 мл мочи 40"6 (диализ не обязателен) и 2 мл 5 10 М раствора ДАФИ в 0,01 Н НБО 4, рН 2,0,В кювету с раствором ДАФИ вносят 20 мкл тестируемого образца мочи и определяют уровень флюоресценции 45 ГФлюоресценция свободного красителя Р- выставляется за 1007 Результаты измерения приведены в табл, 5. Затем строят калибровочную кривую для стандартных растворов ГС в координатах Р (концентрация ГС в мг/мл) (табл.6). Поскольку суммарная концентрация ГАГ в том же образце мочи составила 0,345 мг/мл (пример -1), а концентрация ГС при ЬР, равном 8, составила 0,225 мг/мл, процентное содержание ГС в смеси ГАГ составляет 65,27П р и м е р 5. Определение концентрации ГС в смеси стандартов ГАГ в растворе.Для определения .берут 2 мл 5 1 О И раствора ДАФИ в 0,01 Н НЯО 4, рН 2,0 и 0,1 мл тестируемой смеси ГАГ, содержащей по 0,25 мг/мл ГС и хондро" итинсульфата.Порядок проведения титрования во времени такой же, как в примере 4. Результаты определения приведены в табл, 7. По калибровочной кривой (табл. 6), находят концентрацию ГС,соответствующую значению дР, равному 9 - 0,25 мг/мл.Составитель Л. ШилинаТехред Л.Олейник Корректор О, Луговая Редактор А, Долинич 4910/41 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Заказ Производственно-полиграфическое предприятие,г,ужгород,ул.Пр.ектная, 4 7 12575Формула изобретения Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах путем обработки их 4,6-диамидино-фенилиндолом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени анализа, к раствору 4,6-диамидино"2-фенилиндо 19 8ла добавляют исследуемую среду с пос"ледующим измерением изменения интенсивности флюоресценции,причем при рН5,6-6,0 определяют суммарное содер"жанне гликозаминогликанов по снижению интенсивности флюоресценции,а при рН 2,0 определяют содержаниегепарансульфата по повышению интенсивности флюоресценции.