Способ получения пировиноградной кислоты

б /яр оиооироооолил иогы ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ПИСАНИЕ И ВТОРСИОМУ СВИДЕТ(71) Институт биохимии и физиоломикроорганизмов АН СССР и Эксперментальный завод биохимическихпрепаратов АН ЛатвССР(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ путем аэробного культивирования продуцирующих Ее дрожжей СапйЫа Юро 1 УС 1 са на питательной среде, содержащей в качествеисточника углерода и энергии глицерин, а также источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения выхода продукта,глицерин вносят в начале процесса,азатем поддерживают концентрацию егоне ниже 1 г/л путем периодическойподпитки в таких количествах,чтобыконцентрация непосредственно послевнесения не превышала 46 г/л.510 15 20 35 40 45 50 552Изобретение относится к областимикробиологического получения органических кислот, в частности пировиноградной кислоты, и может бытьиспользовано в микробиологической,химической, пищевой и медицинскойпромышленности.Пировиноградная кислота можетслужить как исходный материал дляпроизводства таких аминокислот, кактриптофан, тироэин или алании, атакже используется как добавка кпродуктам для придания им кислоговкуса,Целью изобретения является повышение выхода пировиноградной кислоты.Выход пировиноградной кислоты может быть значительно увеличен путем дискретной подачи глицерина. в среду 1 периодической подпитки 7 в процессе культивирования, При таком способе (табл,1) внесения субстрата количество накапливающей,ся в культуральной жидкости кислоты в 1,5 выше, а период ферментации . в 1,4 раза короче по сравнению со способом, где то же количество глицерина вносится одноразово в начале культивирования.Влияние дискретной подачи глицери на на выход пирувата (СапйЫа 71.ро 1 ус 1 са 695, культивирование в колбах на качалке ) приведено в табл. 1.При дискретном способе подачи глицерина последний вносят в среду в таких количествах и через такие промежутки времени, чтобы его концентрация непосредственно после внесения не превышала 46 г/л. Как видно из табл,2, при концентрации глицери- на в среде до 46 г/л количество кислоты увеличивается пропорционально количеству субстрата. При содержании же его в среде 50 г/л и выше наблюдается значительное снижение выхода пировиноградной кислоты вследствие ингибирующего влияния высоких концентраций глицерина на дрожжевые клетки.В процессе культивирования нецелесообразно допускать снижение концентрации глицерина ниже 1 г/л, так как это приводит к полному потреб- пению субстрата за короткий промежу- ТоК времени и приостановке процесса ерментации.Влияние концентрации глицерина в среде на выход пировиноградной кис 49069 2 лоты у С. Яро РУ 1 са 695, приведено в табл.2.Ъ.Увеличение выхода пировиноградной кислоты и сокращение времени Фермента ции при дискретном способе подачи глицерина в среду поясняется примера - ми и табл.1.По способности к биосинтезу пировиноградной кислоты 1 табл.3) проверенные штаммы Сапс 1 Ыа Охро 8 у 1 са не имеют существенных отличий от штамма, используемого в прототипе, при культивировании их в идентичных условиях 1 в колбах на качалке в среде с глицерином.Содержание пировиноградной кислогы в культуральной жидкости дрожжей Сапс 1 Ыа 11 ро 1 У 1:1 са приведено в табл.З,.П р и м е р 1. Опыт. ДрожжиСапйЫа ро 1 ут 1 са 695 (ВКМ в 1-2378)выращивают в течение 2 сут при 2830 С в пробирках па агаризованнойминеральной среде Ридер следующего состава, г/л: глицерин 20;(ИН 4)804З,О; МяБО 7 Н О 0,7; МаС 1 0,5;Са(Ю,) 0 4;,КН РО 1,0, К НРО 0,1,агар-агар 25; дрожжевой автолизат2 мп; микроэлементы (смесь Буркгольцера 1, мг/л: К 1 0,1, В" 0,01;11 п+ 0,01;2 п - 0,01; Сп 0,01;11 о 0,01, Ре0,05; вода бидистил-лиров анна я. Клетки из одной пробирки смьгвают 5 мл стерильной дистиллированной воды в колбу объемом 750 мл с 50 мл среды следующего состава, г/л: глицерин 20 (МН) 80 3,0, Мр 80 л н 7 Н О 0,7; Са(МО,) 0,4; ЧаС.1 0,5; КН РО 1,0; К НРО 0,1; тиамин 2 мкг/л, микроэлементы по прописи Буркгольдера, вода бидистиллированная.Посевной материал выращивают 24 ч на качалке 220 об/и/мин/ при 28-30 С. Колбы в опытных вариантах засевают из расчета 100 мг клеток 1 по весу сухой биомассы) на 1 л среды того же состава, которая использовалась для выращивания посевного материала, но количество глицерина увеличивают до 60 г/л и его вносят по 20 г/л в .начале, и через 36 и 72 ч культивирования, когда концентрация в среде соотвественно снижается до 5 и 1 О г/л. Таким образом, концентрация глицерина сразу после внесения составляет в3 249069 начале процесса 20 г/л, черс 325 г/л, через 72 ч - 30, г/л яп:1, , юКультивирование ведут в колбах в на качалке до полного потреблениясубстрата при рН 3,5-6,0 (поддержи- - 3 нают добавлением 57,-ного раствора 2 11 аОН), Изменение концентрации глице рина в процессе ферментации от 5до 30 г/л ке оказывает влияния на д динамику накопления кислоты (биг.1) . и кЧерез 5 сут культивирования в н среде накапливается 36,4 г/л пиро- и виноградной кислоты, что состав-ляет. 60,77, от потребленного субстрата. л Остоякпый уровень рН поддержкват путем нейтрализации 1 О/-пым растором ИаОН,Глицерин вносят .следующим обраом 20 г/л в начале процесса и поО, 10, 15, 35 г/л через 12, 23,6 и 32 ч выращивания, когда его конентрация соответственно снижаетсяо 3,11 5 и 11 г/л. Таким образом,онцентрация глицерина непосредствено после внесения н среду в разныеромежутки времени составляет 20,23,1,20, 46 г/л,За 50 ч происходит полное потребение гпицерина и накапливается51,8 г/л пируната. Изменение концентрации глицерина от 1 до 46 г/лне оказывает влияния на динамикунакопления кислоты /Аиг,2).Контроль. Культивирование ведуткак в опытном варианте, но 100 г/лглицерина вносят н начале процесса.Ферментация заканчивается к 72 ч, всреде обнаружено 38,5 г/л пирони 25 ноградной кислоты.Таким образом, при, дискретнойподаче глицерина выход кислоты увеличивается в 1,34 5, а время ферментации сокращается почти в 1,5 разаП р и м е р 3. Культивированиеведут, как н примере 2, но 100 г/лглицерина вносят следующим образом:20 г/л в начале ферментации, затем44 и 36 г/л через 12 и 38 ч культи-,35ниронания, когда его концентрациясоответственно снижается до 5 и 10 г/л.После внесения глицерина ока составляет 49 г/л после первой и 46 г/л40после второй добавки. Последующее культивирование с целью получения пировиноградной кислоты проводят в Ферментере объемом 1 О л с 5 л среды, имеющей такой же состав минеральных солей, как исреда для посевного материала, Концентрацию тиамина снижают до 4 мкг/л,5 количество глицерина увеличивают до 100 г/л. Посевной материал вносят из расчета 0,4-0,5 г/л (по сухому весу) . 55 Культивирование проводят при 29 С, рН 4,5, концентрации растворенного кислорода 607.от насыщения. Контроль. Выращивание дрожжей ведут как в опытном варианте, но 60 г/л глицерина вносят одноразово в начале культивирования. Субстрат полностью потребляется за 7 сут, за это время накапливается 24,2 г/л пируната (выход 40,3 7 от потребленногоглицерина).Таким образом, при дискретном внесении глицерина в среду количество образующегося продукта увеличивается в 1,5 раза, а время ферментации сокращается.на 48 ч.П р и м е р 2, Опыт. Дрожки СапйЫа 1 хро 1 уса 695 (ВКИ У) выращивают на агаризованной среде как н примере 1 Для приготовления посевного материала используют сре - ду следующего состава, г/л: глицерин 30, (11 Н 4) 80 6,0; Мд ЯО 7 Н О 1,4; ИаС 7 0,5; Са (Юз) 0,8;НРО 4 О 2 микрозлемен ты - удвоенная концентрация (по сравнению со смесью Буркгольдера), тиамин 6 мкг/л. Посевной материал выращивают н колбах на качалке (220 об/мин)24 ч. Ферментация заканчивается через 58 ч, выход кислоты составляет 42,4 г/л (42,4 Х от потребленного субстрата), Такю 4 образом, увеличение концентрации глицерина в среде до 49 г/л при дискретной его подавче на 9,4 Е снижает выход пкруната (по сравнению с примером 21 и на 8 ч увеличивает время ферментации. Таким образом, культивирование дрожжей Сапс 1 Ыа .Йро 1 уса по предлагаемому способу на среде, содержащей н качестве источника углероданепищевое сырье, - глицерин позволяет увеличить накопление пировиноградной кислоты в культуральной жидкости н 4,6-6,1 раза по сравнению с изнест-,1249069 ным способом и в 1,15-1,2 раза посравнению со,способом, по которомудо настоящего времени был полученлучший выход пировиноградной кислоты - 43,6 г/л,но согласно которомуиспользуют в качестве источника углерода пищевое сырье - глюкозу и дефицитную незаменимую аминокислоту -метионин. Пировиноградная кислота Способ внесе-,Количествоглицерина,г/л Длит ельность ферментации ч/л ни 20 36,4 3 6 б лица 2 КонцентрацияглиЦерина, г/л г/л 2,4 5,1 20 О,51 3 50 17,39 24,4 3 а Птаммь Пировиногр ная кислот г/л,6 пользуемый по известному способу. Итамм 60 (20+20+20 ) Дискретный 60 Одноразовый Кроме того, как видно из преДстатленного материала, дискретное внесение глицерина в среду в процессекультивирования по сравнению с одноразовым внесением увеличивает такжевыход пировиноградной кислоты отпотребленного субстрата в 1,341,5 раза и сокращает время фермена тации в 1,4-1,44 раза.Таблица ровиноградная кислота таммы Пировиноград ная кислота,Тираж 490ственного комитбретений и откр Ж, Раушская исное по д 113035, тиинаб., д.4 оектная, 4 изводственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, у Госуд лам и Иоскв го зп ю ю бремя купьти 5 ироания, часы Фиг. г