Способ получения антибиотиков а51568-фактора а и а51568 фактора в

:365) 12 Р 12 К ОБРЕТЕНИЯ ПИСА АТЕНТУ ртин Х ар и (ЦБ)79. 9 (088. 8),Б ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВТОРА А И А 51568-ФАКТОРА Вб получения антибиотиков Гвютанта р 1 Ф 1(Г Ъ1 СН 2)п:С фФ СНз СН -О=СМ Фщ" - 1А онОН чникие солияхспльтуралодукто аащеи ист минеральн ных услов нием из к целевых п штамм 15232 кульеде, содерОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(71) Эли Лилли энд Компани ( де п=1 (А 51568-фактор Ап=2 (А 51568-фактор В аключающийся в том, что осагй 1 а ог 1 еп 1 а 11 я ИКк 1. ивируют в питательной.с(72) Марви Дж. Маркон (53) 615.7 (54) СПОСО А 51568-ФАК (57) Спосо формулы глерода, азота и в глубинных аэроб следующим выделеьной видкости1 11Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков.Целью изобретения является создание способа получения новых антибиотиков, активными против грамположительных микроорганизмов.Для осуществления способа используют штамм Иосагйа огепа 1 дз ЯКИ.15232, который характеризуется сле-дующими признаками.Культурально-морфологическиепризнаки,Имеет субстрактный и воздушныймицелий. Воздушные гифы похожи напаутину, при глубинном культивировании в условиях встряхивания разрываются на короткие фрагменты.Рельеф споровой поверхности гладкий. Форма споры меняется.от сферической до цилиндрической, Образуетспоры в незначительном количествеи нерегулярно.Солодовьй агар с дрожжевым экстрактом (МСП Р 2), Рост обильньй,складчатая .поверхность. Воздушныймицелий обильный, серый. Растворимый пигмент красновато-коричневьй,Крахмальньй агар с неорганическими солями (МСП Р 4). Рост обильный,воздушньй мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимьй пигментотсутствует.Глицерин - аспарагиновый агар(МСП И 5). Рост обильный. Воздушный мицелий обильный, перламутровый белый. Растворимый пигмент светло-.коричневый.Тирозиновьй агар (МСП И 7). Ростобильный. Обратная сторона колониичерного цвета. Воздушный мицелийобильный, желтый, Растворимьй пигменттемный, красновато-коричневьй.Агар Чапека. Рост хороший. Воздушный мицелий хороший, перламутровыйбелый. Растворимьй пигмент светло-коричневый.Агар Эмерсона. Рост обильный,морщинистый, слоистый. Воздушный мицелий хорошо развит, бледно-желтый.Глицерин - глицин . Рост обильный. Воздушный мицелий обильный, перламутровый серый. Растворимый пигментоливково-коричневый.Цельные клетки по сахарному составу относятся к типу А, а клеточнаяоболочка - к типу 1 У;Физиолого-биохимические признаки.Каталаза положительная. 94285 2Разлагает коэеин, ДНК, гипоксантин,тирозин, мочевину, ксантин, не разлагает аденин.Желатину разжижает.Гидролизует эскулин, снятое молоко,крахмал.Меланоидная пигментация отрицательная. Нитрит из нитрата не образует.Фосфатаза положительная.Совместимость с НаС 1 83.Устойчив к лизоциму, пенициллину,рифампицину; чувствителен к бацитра-,цину, новобиоцину.Вырабатывает уреазу. Усваивает углеродсодержащие соединения.и органи-.ческие кислоты.сГрамноложи тельный.Выживает при 50 С 8 ч.Температурньй интервал 10-40 С.Сбраживает углеводы до кислоты:Е (+)арабинозу, целлобиозу, -эритрит,фруктозу, и(+)галактоэу, глюкозу,глицерин, д-инозитол, инулин, Й(+)лактозу, Й(+)мальтозу, д(-)маннит,Й(+)маннозу, Й(+)мелезитоэу, о-метилВ-глюкозид, салицин, сахарозу, Й(+)трефалозу, й(+)ксилоэу; не сбраживаетадонитол, целлюлозу, дульцитол,Й(+)мелибиоэуй(+)рафинозу, 1.(+)рамнозу, 4(-)сорбит.П р и м е р 1. Получение посевнойкультуры первой стадии,Для выращивания Носагйда огдепйа 11 з НКВД. 15232 на скошенном агареготовят следующую среду, г/л:термически обработанная овсяная мука 60,0: дрож 25 К 2 НРОФ 1,0 Фисходный минеральный раствор Чапека 5,0 мл/л; агар 25,0; дистиллиро 40,ванная вода до 1,О.л.. Исходный минеральный раствор Чапека,содержит, г/100 мл: КС 1 10,0; МАЗО7 НО 10,0; РеБО 7 НО 0,2; дистиллированная вода до 100 мл.Перед стерилизацией раствор с рН6,2 доводят до рН 7,3 водным раствором гидроокиси натрия. После стерилизации рН среды 6,7.Споры штамма высевают на скошенный агар вышеуказанного составаи инкубируют в течение 7 дней при30 С. Затем культуру заливают стерильной дистиллированной водой иснимают культуру стерильным инстру 55ментом для диспергирования спори мицелия, 1 мл споровой суспензиииспользуют для засева 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав, г/л; картофельный декстринМаоп НР(высокопористый стиролдивинилбензольный сополимер в формешариков), помещенную в колонкуразмером Зх 25 см. Элюент отбрасывают и колонку промьвают 1 л водыи 500 мл 253-. ного раствора метанолав воде. Смесь антибиотиков элюируютиз колонки дважды по 500 мл 50%-говодного раствора метанола, Факторы А и В одинаково, адсорбируются на НРи элюируют с этой смолы в одинаковых условиях.Фракции элюата оценивают на антибиотическую активность с использованием В. зцЬйд 1 дз. Более активные фракция концентрируют до небольшого объема и лиофилизуют. Получают сырую антибиотическую А 51568-смесь весом.905 мг.П р и м е р 3. Очистка антибиотической А 51568-смеси.Сырую антибиотическую смесь растворяют в 50 мл воды и наносят на колонку размером 1,7 х 44 см, заполненнуюСефадексом СМв. МНуформе, Элюентотбрасьвают, колонку промывают 250 млводы. Затем колонку элюируют элюентом, в котором концентрация бикарбоната аммония нарастает по вогнутойкривой ( Н О - 1 КЯН+НСО, ячейка смешения 100 мл). Собирают 50 фракцийпо 25 мл и проверяют их на антибиотическую активность с использованиемВ, зцЬ 11 дз,Факторы А н В элюируются в различ 35ных фракциях. Для обессоливання продукта отобранные фракции с фактором А наносят на хроматографическуюколонку размером 1,7 х 10 см, запаенную40смолой Расп НРкоторую предварительно вйдерживают в воде до равновесного набухания, и колонку промывают водой, после чего элюируют 100 мл50%-го водного раствора метанола.45Метанольный элюат выпаривают до сухого остатка. Остаток растворяют в небольшом количестве воды и подкисляют0,1 И водным раствором хлористоводородной кислоты. Затем подкисленнуюсмесь лиофилизируют. Получают 25 мгочищенного антибиотического А 51568"фактора А,Для выделения фактора В используют методику по примеру 3 с использованием анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давлениявместо анализа с помощью В.зцЬйъ 1 ьз.Отдельно отобранные фракцииобессоливают аналогично фракции А 3 119428530,0; патока 20,0; бактепентон 7,0;с-тирозин 1,0; дистиллированная во"да до 1,0 л; рН 5,5. Доводят рНдо 7,0, водным раствором гидроокисинатрия перед стерилизацией, послестерилизации рН 6,1.Вегетативный посевной материалинкубируют в 250 мл широкогорлойколбы Эрленмейера при 308 С в течение 48 ч на аппарате для встряхива-. 10ния, вращающемся по дуге диаметром5,08 см со скоростью 250 об/мин.Эту инкубационную среду используютлибо для засева небольших фермента-.торов (концентрация засева 0,8 об. в об.среды)либо для засева сосудов второй стадии предназначенныхдля получения большего объема мицелия,ферментация .А 51568,1. 20100 л ферментационной среды засевают 0,8(800 мл) вьппеописаннойкультуральной жидкостью.ферментационная среда имеет. следующий состав, г/л: полипропиленгликоль (2000) 0,2; картофельныйдекстрин ПдХсо 30,0; патока 20,0;бактопептон ЭНсо 7,0; о-тирозин 1,0; дистиллированная водадо 100 л; рН.5,2. Водным 5 И раствором гидроокиси натрия доводятрН среды до 7, 1, стерилизуют при121 С и давлении 1,19 - 1,33 кг/см 2в течение 45 мин. После стерилизации рН среды 6,2.Ферментацию ведут в 165-литровомферментационном танке в течениеприблизительно 114 ч при 30 С.Аэрацию ведут со скоростью 0,15 У/Ч//мин и перемешивают обычной мешалкой со скоростью около 200 об/минНакопление антибиотика в культуральной среде контролируют центрифугированием образца культуральной.жидкости при 1000 я и декантируют супернатант для анализа. Образец разбавляют фосфатным буфером с рН 6,0и подвергают микробиологическому. анализу испытанием на чашке с агаромс использованием Мсгососсцз 1 цйеизАТСС 8341 в качестве теста-микроба.П р и м е р 2, Выделение антибиотической А 51568-смеси.К 3 л культуральной жидкости,содержащей факторы А и В в соотношении приблизительно 95:5, добавляютфильтровальный брикет (кизельгур)и смесь отфильтровывают. 2,7 л фильтрата с рН 7,8 наносят на смолу194285 6 10 15 диметилформамида получают значения Для удаления соли, добавленной на предыдущей стадии, каждый набор фракций наносят на колонку со смолой 01 ахоп НР, которую элюируют 5%-ным раствором изопропилового спирта, ссодержащего 0,1 Х Н РО Соответствующий набор Фракций на каждой колонке отбирают на основании анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Для набора фракций концентрируют,55 3 1 и получают один продукт, обогащенный Фактором А, и второй продукт, обогащенный фактором В.П р и м е р 4, Выделение, очистка и разделение А 51568-факторов А и В.для отделения А 51568-смеси факторов А и В от культуральной жидкости последнюю фильтруют через фильтр НУГ 1 о яцрегсе 1. После доведения Фильтрата до рН 6,0-6,5 с помощью 50 НС 1 прибавляют смолу попас . Х(Н ) и смесь перемешивают для адсорбции антибиотиков. Супернатант отбрасывают и смолу промывают водой (10 7 смолы), После отбрасывания промывных вод. смолу Хпомещают в колонку, которую элюируют 0,1 Я раствором хлорида аммония ,(5 7 колонки), фракции объемом 4 л сразу нейтрализуют 5 И НС 1. Контролируют антибиотическую активность с помощью Б.аигеоя и жидкостной хроматографии высокого давления. Фракции, содержащие А 51568-Факторы А и В, отбирают и для обессолива-, ния смеси пропускают через колонку со смолой Эха 1 оп НР. Элюент отбрасывают. Затеи смолу элюируют 57-ным раствором изопропилового спир та, содержащим 0,1 Х НЗРО . Фракции по 500 мл собирают и определяют в них антибиотическую активность, Активные фракции соединяют, концентрируют и лиофилизируют.Для дальнейшей очистки продукта и одновременного разделения факторов. А и В загрязненную смесь факторов А и В растворяют в воде и наносят на колонку с СМ-сефадексом С. Колонку элюируют,линейным градиентои от воды до 025 М ИННСО 5, Фракции анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и фракции, содержащие фактор А, собирают отдельно от фракций, содержащих Фактор В. 20 25 30 35 40 45 50 лиофилизируют и получают соответственно практически чистый А 51568- фактор А и практически чистый А 51568-Фактор В.Антибиотик А 51568-фактор А представляет собой белое, аморфное твердое соединение..Элементный состав, 7.: углерода 50,63; водорода 5,07; азота 8,36; хлора 8,19; кислорода 25,16.Молекулярный вес около 1435.Эмпирическая формула СН яС 1 002 .Потенциометрическим титрованием фактора А в 663-ном водном растворе рКа, равные 6,2; 8,8; 10,3 и 12,85(С.=10 мг/мл, вода).Спектр инфракрасного поглощенияв таблетке из КВг, максимум поглощения: 3400 .(широкйй, сильный), 3380(широкий, сильный), 1657 (широкий,сильный), 1587 (средней интенсивности), 1505 (средней интенсивности),1424 (средний), 1396 (средний),1328 (широкий, слабый), 1310 (широкий, слабый), 1231 (средней интенсивности), 1174 (слабый), 1156 (слабый),118 (средний), 1062 (средней интенсивности), 1028 (слабый), 1015 (сла"бый), 990 (слабый), 882 (слабый),881 (слабый) см" .УФ - спектрофотометрия: кислотные или нейтральнь 1 е условия, макснм :278 (5500), 234 (плечо)(Е):302 (6000), 264 (плечо) (10000),Антибиотический А 51568-фактор В -белое, аморфное твердое соединение.,Молекулярная масса около 1437.Эмпирическая формула С БН тзС 1 гф фОЙПротонный ЯМР - спектр фактора Всхож со спектром ванкомицина и фактора А, но отличается отсутствиемрезонанса Ы-СНЯ - ристил/лейцина,имеющего место в спектре ванкомицина и,аспарогиновых резонансов, найденных в спектрах ванкомицина и фактора А, в спектре Фактора В имеютсяоезонансы глутамина,Проявляет активность по отношению к аэробным и анаэробиым бактериям, таким как БарЬУ 1 ососсия апгепя, БгарЬУ 1 ососсця ер ЫегшЫхяд Бггергососспя руояепея, БггерГососсия рпепщоп 1 а 1, Бггергососсця яресгея,7 1194285 8НаешорЫ 1 из дпГ 1 цепвае, ЕвсЬегдсМа Ега 81 дз, ВасйегоЫев гпега 1 огаош 1 ссо 11, К 1 еЪзде 11 а рпецшопае, гоп, ВассегоЫез ше 1 ап 1 поаепсцз, С 1 озггй 1 цш йШ 1 сд 1 е, С 1 озггЫдцш Васгегойз чц 18 агдз, ВасСегоЫез регЕг 1 пяепв, С 1 озсгЫцш верйдсцш, соггойепз, РцзоЬасгегдцш вцшЬдозцш, ЕцЬасгег 1 цш аегоГасдепв, РерГососсцз 5 РцвоЬасгег 1 цш песгорЬогцш.авассЬаго 1 уйдсцз, Рерососсцв ргечо- Антибиотики или их фармацевтичесРерйовСгерсососсцз апаегоЪдцв, ки приемлемые соли применяют для леРерФозггергососсцз 1 пгегшедьцв, , чения инфекцийу людейи животных,при РгоропЫасСегмш аспев, ВасгегоЫев . этом эффективнаядоэа равна 25-2000 мг.Составитель Г.СмирноваРедактор В.Иванова Техред Т,Дубинчак КоРРектор А,ОбручарЗаказ 7332/63 Тираж 524 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4