Способ определения биологической активности химических соединений

СОЮЗ СОВЕТСКИХоаиЛкпввннпРЕСПУБЛИК 01 Б 33/48 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ИЗОБРЕ ИДЕТЕЛЬСТВ САН ЕНИЯ зик ныине 7) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯАКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХпутем взаимодействияединений в растворесветом красителем,щ и й с я тем, что,( 54)(ЧЕС КОИНЕКИЙмых соденнымч а ю БИОЛОГИ СОЕДИ естиру возбуж тли- целью( 21) 35 ( 22) 8 ( 46) 30 ( 71) Ин АН СССР ( 72) Б. ( 53) 57 ( 56) Ав У 7415 5419/28-1302.8311.85. Бюл. У 44титут биологической, кл. О 01 И 33/48. 801143193 А упрощения способа, образец, содержащий тестируемое соединение, краситель и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, а также контроль" образец без тестируемого соединия освобождают от- кислорода, осве щают светом в полосе поглощения красителя и измеряют начальную скорость снижения оптической плотности или флюоресценции красителя или его радикалов.в присутствии тестируемого соединения и контрольного образца, причем среди соединений одного класса большей скорости выцветания соотетствует более высокая биологическая активность.Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для первичной оценки биологической активности химических соединений на стадии предбиологических испыта ний.Изобретение предназначено для отбора наиболее эффективных из биологически активных веществ в ряду новых веществ, полученных путем химической модификации исходного соединения и предназначенных для воздействия на одну и ту же биологическую Функцию.Известен способ определения биологической активности химических соединений путем взаимодействия тестируемых соединений в растворе с возбужденным светом красителем, который заключается в том, что определяют величину начальной вспышки послесвечения раствора хлореллы, которую принимают за 1007, затем в свежий раствор хлореллы добавляют раствор антибиотика заранее известной концентрации и строят стандартную кривую снижения интенсивности начальнойвспышки послесвечения хлореллы вприсутствии известных доз антибиотика. Измеряют интенсивность послесвечения испытуемого образца и по стандартной кривой определяют активность антибиотика, содержащегося в этом образце, т.е, по сути дела его концентрацию, В основе этого способа 35 лежит взаимодействие тестируемого вещества (т.еполиенового антибиотика ) с красителем ( в данном случае - хлорофиллом), находящимся в возбужденном светом состоянии, в резуль тате чего уменьшается флуоресценция клеток хлореллы.Недостаток этого способа заключается в том, что он сложен в связи с необходимостью культивирования 45 хлореллы, предназначен для определе" ния активности только одного класса веществ и мало пригоден для определения биологической активности новых веществ, поскольку не содержит корре ляций между биологической активностью известных соединений и их влиянием на Флуоресценцию хлореллы,Целью изобретения является упрощение способа55Цель достигается в способе определения биологической активности химических соединений путем взаимодействия тестируемых соединений в растворе с возбужденным светом красителем,тем, что образец, содержащий тестируемое соединение, краситель и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, а также контрольный образец без тестируемого соединения освобождают от кислорода, освещают светом в полосе поглощения красителя и измеряют начальную скорость снижения оптической плотности или флюоресценции красителя или его радикалов в присутствии тестируемого соединения, причем среди соединений одного класса большей скорости выцветания соответствует более высокая биологическая активностьСпособ поясняется следующими примерами.П. р и м е р 1. Определение биологической активности нейромедиатора дофамина и предшественников его биосинтеза - с=, ДОФА и тироэина.В оптическую кювету, снабженную вакуумным краном, помещают контрольный образец: 2 мл буферного раствора (трис-НС 0,01 М рН = 7,0 ), содержащего краситель эозин (1.10М) и восстановитель - восстановленный никотинамидофенилдинуклеотид ( НАД-Н, 5.10 М ). Образец освобождают от растворенного кислорода осторожной откачкой на Форвакуумном наеосе 1.10мм,рт.ст,) в течение 30 мин.Деаэрированный контрольный образец помещают в термостатированное кюветное отделение спектрофотометра Сф, позволяющее освещать образец непре-, рывным светом лампы накаливания мощностью 100 ВтНужный участок спект" ра выделяют светофильтром ЖС. Через равные интервалы времени освещения (10 сфиксируют уменьшение мак" симума поглощения красителя на ) = = 517 нм и изображают на графике или в таблице кинетику выцветания красителя.Опытный образец, содержащий кроме зозина и НАД-Н в концентрациях, равных таковым в контрольном образце, также и тестируемое вещество-дофамин (1.ОИ ) подвергают тем же процедурам, что и контрольный, и результаты измерений выцветания красителя наносят на один и тот же график, Аналогичным образом измерены предшественники дофамина 1-ДОФА и тирозин (см. табл.1 ), Из данных3 1143193 табл.1 следует., что дофамин наиболее сильно замедляет выцветание красителя зозина. Как известно из литературных данных, дофамин обладает и наивысшей биологической активностью какнейтромедиатор, являясь конечным продуктом биосинтеза. Менее активен биологически его предшественник о -ДОФА, и он не столь сильно тормозит выцветание красителя,.проявляя более .слабые электронно-акцепторные свойства. Исходный продукт биосинтеза-тирозин, характеризующийся незначительным медиаторным действием, в наименьшей степени влияет на кинетику фотовыцветания зоэина. Таким образом, имеет место корреляция между биологической активностью изученных веществ и их способностью замедлять фо" 5 товыцветание красителя, т.е. ихэлектронно-акцепторными качествами. Обнаруженная корреляция биологи ческой активности производных дофамина с их электронно-акцепторными свойствами позволяет прогнозировать биологическую активность новых лекарств на основе дофамина путем иэ мерения их электронно-акцепторныхсвойств. Таблица 1 Кинетика выцветания красителя (дА) зозина в контрольном образце в присутствии дофамина и предшественников его биосинтеза Ы-ДОФАи тирозина.30 20 1 О Выцветание 25 40 14 26 50 Контроль Тирозин Ы-ДОФА Дофамин 37 1 2,5 4 1,5 0,3 0,7 1 П р и м е ч а н и е: Выцветание красителя зА ) указано в делениях шкалы спектрофотометра СФО. Для,получения выцветания красителя в единицах оптической плотности указанныецифры нужно умножить на 0,0125 д,. П р и м е р 2. Определение биологической активности нейролептиков-аминазина (хлоропромазина ) и его производных. 50Исследуют аминазин и его производные: этаперазин й трифтазин.Поскольку нейролептики образуют прочный комплекс с зозином в качестве красителя, в этом примере исполь зуют флуоресцеин-краситель близкий по строению к зоэину. Об образовании комплекса свидетельствует смещение полосы поглощения зозина в присутствии этих веществ. Контрольный образец, содержащий 2 мл буферного раствора (.трис-НС 1 0,01 М рН 7,0), краситель флуоресцеин 0.10 М) и восстановитель НАД-Н (5.10 )помещают в оптическую кювету, снабженную вакуумньк краном и под" вергают процедурам, описанньм в примере 1. Через каждые 15 с фиксируют уменьшение максимума поглощения фдуТаблица 2 Концентрации производных аминазина, вызывающие одинаковое замедление выцветания зозина эа первые 5.с освещения образца и их известная биологическаяактивность Аминазин Этаперизин Трифтазин Концентрация, вызывающая равное замедление выцветания, М 5. 0 1,7.10 5 20-80 501 43 оресценции на В490 нм и строят кривую его кинетики выцветания.Опытный образец, содержащий 2 мл буферного раствора (как и контрольный), флуоресцеик и НАД-Н в тех же концентрациях,что и контрольный образец, а также тестируемое вещество - аминазин, подвергапи тем же процеду" рам, что и контрольный образец и строят кривые кинетики выцвечивания О флуоресцеина в присутствии аминеэина при следующих его концентрациях: 5.10- и и 1,7.ОМ.Затем последовательно были построены кривые выцветания флуорес Суточная доза, мг До 800 Как видно из табл 2, одинаковую степень замедления выцветания красителя наблюдают при различной концентрации нейролептиков - наименьшей у трифтазина (5.10М )и наибольшей у исходного вещества - аминазина (1,7.10 М 1 В той же последовательности находится и их биологическая активность, определяемая по суточной дозе. В данном примере наблюдается и количественная пропорциональность между физиологической активностью членов гомологического ряда (доза ) и интенсивностью их электронно-акцепторных взаимодействий с радикалами красителя ( концентрация вещества, в заданной степени замедляющая выцветание красителя .П р и м е р 3. Определение биологической активности нейромедиатора норадреналина и его антагонистов фентоламина и атенолола, веществ,93 Ьценна в опытных образцах, содержащих (кроме флуоресцеина и ИАДН в буферном растворе , как и контроль )производные аминазина в различныхконцентрациях: атаперазин 1,6,10 Ми 3.О- М и грифтазин 1,5,)0 М и На основании полученных кривых определены концентрации аминазина и его производных, при которых происходит одинаковое выцветание флуоресцеина за первые 5 с освещения образца. Эти данные приведены в табл.2. характеризующихся противоположнымвоздействием на функцию передачинервного импульса и сопоставлениеее с их биологической активностью,описанной в литературе,Исследуют норадреналин, фентоламини атенолол. Противоположное физиологическое действие тестируемых веществпредполагает, что одни иэ них являются акцепторами, другие - донорамиэлектронов. Свойства доноров электронов целесообразно оценивать приимпульсном освещении образцов.Контрольный образец, состоящийиэ 2 мл буферного раствора (трисНС 1 0,01 М, рН = 7,0 ),содержащегокраситель зоэин (1.10М ) и восстановитель НАД-Н (5.10М )помещаютв оптическую кювету, снабженную вакуумным краном, освобождают от раство"ренного кислорода (как описано впримере 1) и помещают в кюветное отТаблица 3 Константы скорости реакции с радикалами зозина медиатора нервной проводимости норадреналина и блокаторов этого процесса - фентоламина и атеноллолаНорадреналин Фентоламин Атеноллол Константа скоростиреакции с радикалом зоэина +4,0.10 М с " -5.10 М с -5.10 И с" Биологическое действие Нейромеди" Блокатор Блокаторатор"ВНИИПИ Заказ 7043/4Тираж 896 Подписное Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 7 11431 деление импульсного спектрофотомет" ра, освещают импульсом света длительностью около 50 мкс и на запоминающем осциллографе типа С 8-7 А фиксируют кинетику исчезновения анионрадикалов зоэина на 3 " 420 нм (по изменению оптической плотности).Опытный образец, содержащий 2 мл буферного раствора трис-НС 1 (как и контрольный ) зозин и НАД-Н в тех О же концентрациях, что и контрольный образец, а также тестируемое вещество норадреналин 1,4.10 М), фентоламин (3.10 М ) или атеноллол (3. 0-М ) подвергают тем же процедурж, что .и 15 Константам скорости условно приписаны разные знаки, чтобы подчеркнуть противоположный характер взаимодействия норадреналина и его антаго нистов с радикалами красителя.Таким образом, взаимодействие тестируемых веществ с радикалами красителя позволяет выбрать наиболее активное вещество гомологического45 ряда по наибольшей величине скорости его реакции с радикалами красителя или различать вещества с антагонистическим биологическим действием по их противоположному характеру взаимодействия с радикалами.Использование предлагаемого способа по сравнению с известным способом позволяет быстро сделать оцен 93 8контрольный образец (как описано.выше в этом же примере ). Затем полученыкривые кинетики исчезновения анионрадикалов зозина в присутствии тестируемых веществ. По известной концентрации тестируемых веществ, разности контрольной и опытных кинетических кривых исчезновения радикалов и начальной концентрации радикалов стандартным образом вычислены константы скорости взаимодействия тестируемых веществ с радикалами красителя., которые представлены в табл.3,ку биологической активности химических соединений в пределах одного гомологического ряда и отобратьнаиболее перспективные перед ихпроверкой на биологических объектах и тем самым сократить объем биологически тестируемых веществ . Кроме того, предлагаемый способ позволяет оценивать биологическую активность химических соединений различных гомологических рядов, а такжеспособствует ускорению создания веществ с заданной биологической активностью путем сопоставления результатов химической модификации известного вещества с его электронно-акцепторными и донорными характеристикаавизмеряемым предлагаемьж способом.