Урокиназа, иммобилизованная на гепарине

;, 1137 Г 60 ННЫЙ НОМИТ окиназа, -46, нгирован ностью и и харак етрами: и= 2 обладающая прол литической актив рующим действие следующими пара ой тромбоантикоагул еризующаяс 70000+9000 20-30 мас,70-903(от исходной Специфичес активность 150000-20000010 урокиназыина,. 100010 гепар(21) 3551782/28-13 (22) 2.12.82 (46) 07.09.85. Бюл. Р 33 (72) А.В. Максименко, Е.Г, Тищенко, В.П. Торчилин и В.Н. Смирнов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (53) 577.15(088.8) (56) 1. Патент США У 4106992, кл. 195-66 В, 1978.2. Авторское свидетельство СССР В 824053, кл. С 01 И 33/86, 1979. (54)(57) УРОКИНАЗА,ИММОБИЛИЗОВАННАЯ НА ГЕПАРИНЕ, общей формулыо=с-н- гр ц 4 С 12 И 9/72, 11/00// А 61 К 37/48 Молекулярная массаСодержание белкаСохраняемая каталитическая активность., и = 27-46,дующими пара"Ф 000+9000 -30 мас.% 70-90% (отисходной) Специфическая ание ур т через ации ка с после аминогр киназы с гепарино стадию карбодиимид боксильных групп ующнм взаимодейппами фермента Связыв происход ной акти гепарина ствием с (схема 1 1 1137Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к синтезу биологически активных химических соединений, обладающих тромболитическойи антйкоагулирующей активностью,5Предлагаемые соединения представляют собой продукт связывания урокиназы с гепарином. Урокиназа, являясьактиватором плаэминогена в организме,применяется как тромболитический "Оагент. Гепарин представляет собойантикоагулирующее средство. Обычновся тромболитическая терапия ведетсяна фоне гепаринизации.Известны производные урокиназы, 15представляющие собой комплекс урокинаэы с гепарином, основанные на ихэлектростатическом взаимодействии,которые получают инкубацией ферментас гепарином 1 1. В смесях гепарина Юи урокиназы образуются наибольшиеколичества производных, представляющих собой урокиназу, электростатически связанную с гепарином.Получаемые таким способом производные представляют собой урокиназу,электрически связанную с гепарином,Однако стабильность этих производных оказывается сильно зависимойот величин ионной силы и рН раствора, что является препятствием дляих использования в терапии.Соотношение активностей компонентов такого комплекса составляет30000-100000 10 урокиназы на 100 1 Нгепарина, Количество гепарина в ком 35плексе (100 Ю) недостаточно дляпроявления значимого эффекта антикоагулянта в организме. Увеличение дозы препарата гепарината урокинаэы40приводит к тому, что наряду с увеличением количества гепарина (и следовательно, антикоагулирующей активности) увеличивается и количествосвязанной с ним урокиназы. Избытоктромболитика вызывает подавлениесистемы свертывания крови.Таким образом, данный комплексурокиназы с гепарином не характеризуется сбалансированным соотношением его компонентов, пролонгированной;и повышенной тромболитической актив-ностью.Целью изобретения является полу- .чение нового препарата - иммобилизо., ванной урокиназы, обладающей тромболитической активностью и антикоагулирующим действием. Цель изобретения достигается засчет свойств иммобилизованной уроки.назы общей формулы де НН-Ур - урокиназа арактеризующейся сле етрами:Молекулярная масса Содержание белкаСохраняемая каталитическая актив- ность активность 150000-2000001 Н урокинаэы/100 10гепаринаКш (93-9,94)10 4 М .Ксан. 25-29 с-"рН-оптимум 7,3-8,5 и получаемой Связыванием урокиназы с гепарином в слабощелочной среде при температуре от 0 до 25 С в течение 2-20 ч. Значения и, как и в молекуле гепарина, составляет 27-46.Способ осуществляют следующим образом. В 0,01-0,1 И фосфатном буфере рН 8,08,5 растворяют гепарин, к которому затем осторожно добавляют избытоккарбодиимида. Смесь инкубируют в течение получаса на холоду, а затемк ней добавляют раствор урокиназыи проводят инкубацию еще в течение2-20 ч при температуре от 4 до 25 С.После этого полученное производноеподвергают очистке диализом в течение 6 ч против дистиллированной воды и лиофилиэируют.+Е - МН 2 Х-С%Н 1 Н осТаким образом описываемого пре тать: возрастани активности предл (в 1,5 раза). пр рованного характ преимуществам рата следует тромбойитнче аемых соедин ание ей прол а, а также и инии нги явПолученный продукт представляет собой урокиназу, ковалентно связанную с гепарином. Синтезированные производные водорастворимы, что весьма удобно,для их повседневного 4 клинического использования. На фоне гепарина заметно эффективнее действует фермент-тромболитик. Модифика" ция урокиназы существенно не меняет ее кинетических свойств, не изменя ется и термостабильность, зато тромболитическое действие приобретает пролонгированный характер. Остаточная каталитическая активность производного урокинаэы в физиологических условиях составляет 0-903 от первоначальной активности нативного фермента ление у них новых свойств - привитой антикоагулирующей активности.В результате для медицинской практики предлагается новое вещество - препарат комплесного пролонгированного действия на ферментной основе,Увеличение молекулярной массы синтезированного препарата способствует увеличению срока его действия в кровотоке.П р и м е р 1. В 4 мл 0,05 М ф фатного буфера рН 8,3 растворяют 8 мг гепарина, к которому осторожно добавляют на холоду (4 С) 5 мг 1-этил-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и смесь инкубируют при перемешивании в течение 30.мин, Затем к инкубационной смеси добавляют 1 мп раствора урокиназы 50,000 10/мл и инкубацию продолжают при 4 С в течеиие 16 ч. После этого раствор диализуют против дистиллированной воды ,в течение б,ч и лиофилизируют, В ре 1137760Продукты примеров 1-4 осуществляют катализ этой реакции по той жесхеме. При этом модификация урокиназы гепарином существенно не меняеткинетические свойства урокиназы.В табл. 1 приведены кинетическиепараметры реакции гидролиза метилового эфира ацетилглициллизина нативной и модифицированной урокиназойпри 25 С 0,1 М КС 8 и рН 7,8 (оптимумэстеразной активности).Таким образом, каталитическиесвойства модифицированной урокиназы,изученные на реакции гидролиза метилового эфира ацетилглициплизина,вполне сравнимы с каталитическимисвойствами нативной урокиназы.Тромболитическую активность нативной и модифицированной урокиназыопределяли по известной методике 21.с добавлением в раствор буфера0,33 мг/мл плазминогена человека.Препараты нативной и модифицированной урокиназы используют в соотношении, обеспечивающем .одинаковую оптическуй плотность при 280 нм. Результаты экспериментов приведены втабл. 2 (рН 7,4, комн. температура) .Сд с представляет собой отношениеприроста оптической плотности раствора (в результате деструкции притромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и перехода его фрагментов в раствор) к величине промежутка времени, за который оно произошло, и характеризует скоростьпроцесса тромболизиса,Представленные в табл. 2 данныепоказывают, что в результате модификации урокиназы гепарином тромболитическая активность полученного ферзультате осуществления реакции связывания с гепарином взаимодействует90 Х белка от его исходного количества (пд данным гельфильтрации на се-.5фадексе Г), при этом ферментсохраняет 907 эстеразной активностиот первоначальной. По термостабильности полученное производное весьмаблизко к нативному ферменту, известному, своей термостойкостью. Специфическая активностьполученного производного 45000 1 мл, содержание белка30 мас.7,П р и м е р 2, Процесс осуществляют также, как и в примере 1, заисключением того, что реакцию связывания урокиназы с гепарином проводятв 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0,С гепаринОм связывается 807. исходного белка, при этом фермент сохраняет 787 эстефазной активности, ипо термостабильности не уступает нативной урокинаэе. Специфическая активность полученного производного 2539000 1 Ямл, содержание белка по весу 267,. П р и м е р 3, Процесс осуществляют так же, как в примере 1, заисключением того, что реакцию связы- ЗОвания урокинаэы с гепарином проводятв 0,01 М фосфатном буфере рН 8,5.С носителем связывается 857 исходного белка при сохранении 757. исходной эстеразной активности. Специфическая активность 37000 10/мл,.содержание белка по весу 247П р и м е р 4. Процесс проводяттак же, как и в примере 1, за исключением того, что реакцию связыванияурокиназы с гепарином осуществляютв 0,01 М фосфатном буфере рН 8,3при 25 С в течение 2 ч. В реакциюсвязывания вступает 857 белка от исходного, сохраняемая каталитическая 4эстеразная активность ферментного .Фпроизводного 757. Кинетические свойства препарата, его термостабильностьблизки тем, что и в примере 1. Специфическая активность 38000 1 П/мл, со- Одержание белка по весу 257.Таким образом, из приведенных при- .меров следует, что количество связанного с гепарином фермента меняетсяв зависимости от рН инкубации. Диана"зон рН 8,0-8,5 является оптимальнымдля протекания двух реакций: активации карбоксильных групп гепарина карбодиимидом и взаимодействия ихс аминогруппами урокинйзы, Именнополученные при таких значениях рНферментные производные (примеры 1-4)обладают наилучшими свойствами, Так,реакция каталитического гидролиза нативной урокиназой метилового эфираацетилглициллизина осуществляетсяпо схеме активации хода .реакции еесубстратом (схема 2) . К 5 2 Е+ Б - ф ЕБ - "Е+РПрепарат 31 Натнвная урокиназаПродукт примера 1Продукт примера 2 2,87 1,33 1,33 9,5 29 7,9 1,35 27 9,83 8,1 1,31 Продукт примера 3 9,94 25 8,5 1,30 Продукт примера 4 28 9,3 1,33 Таблица 2 Препарат, Нативная урокиназа 100 0,20 Продукт примера 1 Продукт примера 2 Продукт примера 4 0,33 165 145 0,29 0,27 135 ментного производного возрастает при.близительйо в 1,5 раза, что являетсявесьма важным для тромболитическойтерапии,Антикоагулирующее действие препаратов модифицированной урокиназыизучали на богатой тромбоцитарнойплазме кролика. Показано, что послепредварительной инкубации препаратовнативной урокинаэы и производныхгепарин-урокиназы (100-250 ед/мп,5-15 мин, 25 С) с богатой тромбоцитарной плазмой кролика не обнаруживается различий в предотвращенииагрегации тромбоцитов и реакциивысвобождения АТФ из них, индуцируемых тромбином (1 мИ), Это свидетельствует о том, что по активностигепарин в связанном с урокинаэойвиде не уступает свободному гепарину. Таким образом, ковалентное свя зывание урокиназы с гепарином неухудшает терапевтических свойствурокиназы и гепарина и позволяет 137760 8получить препарат комбинированного,,цействия,Получение тромбоЛйтических средстврасширенного спектра действия, в% том числе и производных урокиназы,обладающих тромболитическим и антикоагулирующим действием, позволяетразрабатывать новые, высокоэффективные способы тромболитической терапии,1 О Предлагаемый препарат модифицированной урокиназы отличается не толькоболее высокой тромболитической активностью чем нативная урокиназа, нои пролонгированкюм действием. ЭтотИ препарат дает возможность перейтиот струйных методов введения к инъекционным, сскратить продолжительность терапии, уменьшить дозы назначаемых больному лекарств и соответ 20 ственно уменьшить риск "лекарственнойболезни"., Все зто позволит широкоиспользовать эти препараты для лечения тромбоэмболий, инфаркта миокардаи заболеваний кровеносных сосудов,Скорость лизиса тромба