Способ получения молокосвертывающей протеиназы 1-8

(19) 9 58 зсЮ С ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ЕНИЯ .". П ТВУ СНИДЕТЕЛ ТОРСИ Р 32 Н,А,Жеребцовхнологический детельство С9/54, 1980.тельство ССГ15/00, 1978(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСАЮЩЕЙ ПРОТЕИНАЗЫ КН 120 РНБ РУСМА предусматривающий экстракцию туры продуцента водой и осажд ЕР- НЕБ Рм кул вам(21) (22) (46) (72) (71) инст (53) (56) 1 Ф 73 НИЕ ИЗОБР 3555437/28-1301, 12. 8230. 08. 84. Бюл.Л.В.Антипова иВоронежский теитут577.15(088.8)1. Авторское сви2382, кл, С 12 МАвторское свиде1488, кл. С 12 В 0ДФФааа тЫ д ние фермента, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияудельной активности целевого продукта, осуществляют фракционированное осаждение фермента иэ экстрактас помощью сульфата аммония, взятогов количестве сначала 0,2-0,3, а затем 0,60-0,85 от степени насыщения,полученный ферментный осадок растворяют в воде и подвергают термоооработке при 55-60 С и рН 3,5-4,0 вприсутствии ионов Са + в количестве 0,20-0,25 г.-а./л с последующимдиализом, фракционированием на сефадексе Си концентрированиемацетоном в соотношении 1;2.1110801 35 1Изобретение относится к ферментной промьппленности и предназначено для получения монофермента кислой термоустойчивой протеиназы, обладающей молокосвертывающей активностью.5Известен способ получения протеиназы Вас 111 ив йЬог 1 пд 1 епв 1 в айаг ЕдпдСдппдв, включающий осаждение протеиназ сульфатом аммония при 0,8-0,9 насыщения с последующим диализоми очисткой целевого продукта на сефадексах Г 13.Однако этот способ характеризуется недостаточной чистотой фермента, большими примесями пигментов, большой длительностью цикла из-за применения нескольких хроматографических методов,Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности является спо соб получения молокосвертывающейпротеиназы Юпгоров руяшапев р ,предусматривающий экстракцню культурыпродуцента водой и осаждение ферментаорганическими растворителями. В результате получают молокосвертывающую протеиназу с активностью500000 ед/г Г 23.. Однако способ характеризуется не -30 достаточно высокой удельной активностью получаемого Фермента.Целью изобретения является повьппение удельной активности целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения молокосвертывающей протеиназы ВЫгоров рураацев р , предусматривающему-8 ф40 экстракцию культуры продуцента водой и осаждение фермента, осуществляют фракционированное осаждение фермента из экстракта с помощью сульфата аммония, взятого в количестве сначала 0,2-0,3, а затем 0,60-0,85 от сте 45 пени насыщения, полученный Ферментный осадок растворяют в воде и под"о вергают термообработке при 55-60 С+Х и рН 3,5-4,0 в присутствии ионов.Са в количестве 0,20-0,25 г-а./л с пос ледующим диализом, фракционированием на сефадексе Си концентрированием ацетоном в соотношении 1:2.Выход молокосвертывающего Фермента по белку составляет 1,98-2,007, 55 удельная активность на единицу белка, в пределах 760-800 ед/мг, степень очистки 65-90 раз. 2Способ получения молокосвертывающей протеиназы заключается в следующем.Воздушно-сухую поверхностную культуру микромицета ВМгорцв рудтпацев р , известного как активный проду 1+ицент кислых протеиназ с молокосвертывающим эффектом, настаивают с дистиллированной водой в соотношении 1:10 при 30 С в течение 1,0-1,5 ч для экстракции ферментовФерментативную вытяжку с содержанием белка 54-56,мг/мл отделяют от нерастворившегося осадка путем фильтрования через складчатый фильтр, Полученнуюо вытяжку ферментов охлаждают до 4-5 С и вносят сульфат аммония в количество 0,2-0,3 насьпцения, вьдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин и отделяют неактивный осадок балластных белков центрифугированием при 4,0-4,5 тыс. об/мин. Указанные пределы концентрации добавления сульфата аммония установ,лены экспериментально и обеспечивают максимальное удаление неактивных бел, ков, При снижении концентрации менее 0,2 насыщения не наблюдается эффекта полного удаления балласта. При увеличении концентраций свьнпе 0,3 наблюдаются значительные потери продукта, В центрифугат снова вносят сульфат аммония в количестве 0,60-0,65 насыщения (до конечной концентрации 0,80-0,85 насыщения). Такие пределы концентрирующего агента установлены для данного ферментного комплекса экспериментально.При снижении концент-. рации ниже этих пределов значительно уменьшается выход молокосвертывающей протеиназы, При повышении концентрации вьппе этих пределов выход целевого продукта не увеличивается, а степень очистки уменьшается, видимо, за счет присутствия большого количества осадителя в активном осадкеСмесь снова вьдерживают в течение 20 мин для формирования осадка активных ферментов и отделяют его центрифугированием при 4,0-5,0 тыс. об/мин.Как показали результаты фракционирования полученного препарата методом дискового электрофореза и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, в его состав входят 6 белковых фракций, одна из которых обладает молокосвертывающей активностью и интенсивно гидролизует белки в кислой зоне рН. Для быстрой инактивации и удаления1110801 55 сопутствующих ферментоволученьп препарат растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят рН раствора до 3,5-4,0 с помоо щью НС 1, нагревают смесь до 55-60 С и вносят ионы Са в виде соли СаС 1+гв количестве 0,20-0,25 г.-а,/л. При этом степень очистки возрастает в 2-3 раза. Экспериментально установлено, что для эффекта полной инактива ции всех ферментов, за исключением протеиназ, необходимо обязательное сочетание всех трех факторов физико- химического воздействия, Снижение концентрации ионов Саниже указан ных пределов приводит к снижению степени очистки и уровня инактивации, Увеличение ее не влияет на выход протеолитического комплекса, а степень очистки снижается из-за загряз .нения раствора дополнительно вводимой солью СаС 12 .Анализ активности ферментов показал, что после внесения ионов Са и повышения температуры до 50 С про теолитическая активность сохранялась на 100 при полной инактивации липазы и других ферментов. Однако в комплексе сохранялась активная глюкоами-, лаза. Для ее инактивации необходимо 30 поддерживать низкий уровень рН в пределах 3,5-4,0. При этом наблюдается полная инактивация глюкоамилазы при сохранении 90-933 активности протеолитических ферментов. При увеличении температуры выше указанного предела происходит интенсивная денатурация интересующего фермента, при температуре ниже указанного предела не наблюдается эффекта полной инактивации глюкоамилазы. Аналогичное явление наблюдается и при изменении интервала рН.Неактивный осадок ферментов отделяют центрифугированием при 6,7 тыс. 45 об/мин. Анализ активности центрифугата методом дискового электрофореза показал, что в нем сохраняются две белковые фракции, которые обе активно гидролизуют субстраты в кислой зоне рН, одна из них обладает молокосвертьвающей активностью.Разделение протеолитических фракций производят следующим образом.Центрифугат обессоливают проточ - ным диализом в течение суток при 5-4 С, Для фракционирования протеиназ используют метод разделения по признаку молекулярного веса на сефадексе С. Элюирование ведут на колонке размером 1 35 см дистиллированной водой. В результате получают две кислые монопротеиназы, одна из которых (по количественному содержанию в 9 раз большая) обладает молокосвертыванием, а также высокими термо- и кислотдустойчивостью, На последнем этапе очистки проводят концентрирование целевого фермента ацетоном в соотношении 1:2Необходимость разделения протеолитических фракций вызвана тем, что примеси сопутствующих ферментов и, особенно протеолитических, вызывают неспецифический протеолиз субстрата; кроме того, для глубокого исследования, физико-химических свойств и проведения индентификации сэталоном сравнения необходимо получение монофермента.П р и м е р 1. 10 г воздушно- сухой культуры КЬ.рураацез р настаивают в 100 мл дистиллировайной воды в течение 1,5 ч при 30 С. Смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр.фильтрат охлаждают до 4 С и вносят 0,2 насьщения сульфата аммония. Неактивный осадок балластных белков удалют центрифугированием при 4,5 тыс. об/мин. В центрифугат добавляют 0,6 насыщения сульфата аммония (конечное содержание 0,8 насыщения). Активный осадок ферментов отделяют центрифугированием при 4,5 тыс. об/мин и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Затем вносят ионы Сав количестве 0,20 г.-а./л (в виде соли СаС 1) доводят рН смеси до 4,0 с помощью ЙС 1, нагревают доо60 С и выдерживают в течение 15 мин. Неактивный осадок отделяют центрифугированием при 6 тыс. об/мин, Центрифугат обессоливают по известному методу диализа в течение суток при 5 С. Обессоленный раствор собирают количественно и фракционируют объемно по 5 мл на сефалексе С, Фракции, обладающие молокосвертывающей активностью, объединяют и концентрируют ацетоном при соотношении 1:2. Общие данные по результатам получе 1 ния молокосвертывающей протеиназы представлены в табл. 1.П р и м е р 2, Ферментную вытяжку воздушно-сухой культуры КЬ, руяшаез р 8 готовят аналогично примеру 1. В фильтрат вносят 0,3 насьпщения сульфата аммония, отделяют неак1110801 начало образования сгустка через 40 мин после его внесения в молоко. Расчет ведут по формуле где 50 -10 2400 -Технико-экономическая эффективность изобретения состоит в том, что препарат молокосвертывающей протеиназы обладает активностью 710000 - 20 750000 ед/г, что более, чем в 7 разактивнее эталона сычужного фермента, применяемого в сыроделии, молокосвер.тывающая активность которого100 000 ед/г. Таблица 1 Стадии полученияфермента Выход, Х Степень очистки молокоБелок, мг/мл Молокосвертывающая активностьед/млферментной вытяжки По белку По актив- ности удельнаяед/мгбелка свертывающегофермента Исходная ферментная вытяжка 54,00 666,6 12)34 0,00 100 100 Фракционированиесульфатом аммония 44,40 2666,6 60,06 4,88 14,8 70,0 Инактивация иудаление сопутствующих ферментов 125,03 10,13 20,00 2500,6 25,8 63,0 9,80 1500,0 153,06 12,40 20,23 Диализ 59,8 Фракционированиена сефадексеС1,60 400,0 250,0 20,25 9,89 47,8 Концентрированиеацетоном 65,84 Оф 96 750 вО 781 э 25 1,98 29,64 тивный осадок центрифугированиемпри 4,5 тыс. об/мин, В центрифугатдобавляют 0,55 насыщения сульфатааммония и отделяют активный осадоканалогично прщчеру 1. Затем егорастворяют в 5 мл дистиллированнойводы, вносят 0,05 м Са+2 (в видесоли СаС 1), доводят рН среды до3, 5 с помощью соляной кислоты, наогревают смесь до 55 С и выдерживают20 мин. Отделение неактивного осадка, обессоливание, фракционированиеи концентрирование молокосвертывающей протеиназы производят так же,как и в примере 1. Данные показаныв табл. 2,Ферментативную активность определяют на натуральном обезжиренном0молоке при рН 6,5 и 35 С. При внесении фермента регистрируют времяначала образования молочного сгусткавизуально.За единицу активности принимаютколичество фермента, обеспечивающее 2400 50СЧ собъем молока, взятый для анализа, мл;концентрацщг раствора фермента, г/100 мл,объем исследуемого раствора фермента, млсравнительное время образования сгустка, с.1110801 Т а блица 2 Выход, Х Иолокосвертывающая активность Белок, мг/мл Стадии полученияфермента По белку По актив- ности ед/мл удельная,ед/мл белка Исходная ферментная вытяжка 0,00 100,00 100,00 54,00 666,6 12,34 Фракционированиесульфатом аммония 44,50 2700,0 61,00 72,00 15,5 5,0 122,6 150,6 64,0 10 э 05 26 э 8 12,52 21,23 59,9 10,3 1500,0 Фракционированиена сефадексеС1,65 450,0 213 9,90 47,5 250,0 Концентрированиеацетоном 30,02 1,04 800,0 80,0 2,00 800,3 Составитель О.СкородумоваТехред О.Неце Корректор И.Эрдейи Редактор Т.Колб Заказ 6263/21 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5