Способ получения молокосвертывающего фермента

О П И С А Н И Ед 11 з зб 7 5 7ИЗОБРЕТЕН ИЯСоюз Советских Социалистических Реслублик(22) Заявлено 187 о 801,1,3 01,7 23) Приоритет - (32) Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретени Оянная фцомядес Продуйтс Нестле СЛ"йцярця) Инос71) Заяви 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСВЕРТЫЗАЮУЕ фЕРМЕНГА2 быть использовано в промышленности для вызывающих свертывя Изобретение можетферментной и молочнои зом. Кул рующиьтивируют микроорфермент, в качестве котамм 491,61 Рщийся к к у ганизмь продуциорых исполт ОЕусераЕЦгов,Микроорганизм ности твердой под состоянии, няприм бях цли бродильно Прц выряшцвянпу 5 От О тпМИКСОМИЦв фаземой РЕо 5неравном ы вырешивложки илцер, во встм чапе. т на поверх с о погруженномхпваемых колоста нахотпод 1 итп и рную мас Этот микроорганизм дится в форме, называ представляющей собой оверхностц в пцтяцл на получения ферментов, вьние молока.Известен способ получения молокосвертывающего фермента путем культивирования микроорганизмов, продуцируюших фермент на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях с последующим выделением фермента из этой питательной среды 11,Предлагается в качестве микроорганизмов, продуцирующиХ молокосвертывающий фермент использовать Р 1 тУыцтп роЕУсерйоЕитл,При этом из микроорганизмов рпУ 5 с 4 готп роЕУсерЬсй Еотп используют штамм 491,61,Способ осуществляют следующим обрасу протоплазмы, содерж яшуло мпсжествоядер, не рязделенньх ня клетки. имеет желтую Окраску ц покрывает собой пескс чькоквядоятпых сянтцметОов, Б бяягопрця топяхдля жизне еятельнйстц у с повиях пляз.Од цР)луоок,"щ РОЕусер)-,д Енто растет в лаообя;и.условиях прц 20-2 О С В водной пцтю е-нойсреде прц рН 4,5-4,.6, Прц этом водная пцтательняя среда содержит цсточпцкп углерО -да, азота, я так:ке миперяльпь.о соли, сроме того, пит,.тельная среда може; содержатьвитамин, факторы роста ц микроэлементы,я также такие исто,нцк 1 л углерода, кяк глОкоза, гцдролцзяты протеинов, экстрах-.ы дрмжей и эмбриона кур, причем гидролизятыпротеинов и экстракты дрожжей ц эморионякур могут быть заменены соответственносмесью аминокислот, бцотцном цли гематцтельную среду добавляют агар в предварительно стерилизованную водную питательную среду, содержащую глюкозу, экстракт дрож- жеЛ, гидролизат протеина, минеральные соли и гематин, при этом последний добавляют после стерилизации водной среды. В указанную питательную среду вносят микроорганизмы УЪбагитп роЬсеВаГцтп, заливают в чашки Петри и выдерживают при 25 оС,Культура развивается в течение несколь-ких дней, покрывает поверхность чашекПетри и остается в форме плазмодия в течение 7 дней до появления склеротия.Выращивание на поверхности осуществляют также на фильтровальной бумаге, питае 15мой жидкой питательной средой, с помощью капилляров,В случае роста микроорганизмов в погруженном состоянии микроорганизмы РНчба 201 отп роСмсерпсСотп имеют вид плазмодия,разделенного на мелкие частички (микроплазмодий) и находящегося в питательнойводной среде во взвешенном состоянии.В случае выращивания в колбе в последнюю вводят предварительно стерилизованнуюпитательную среду, затем вносят плазмодий,полученный из культуры на поверхности илииз культуры в погруженном состоянии, Выращивание проводят при 25 оС при встряхивании колбы для насыщения микроорганизмакислородом,После скрытой фазы, которая длится 1 2час, если инокуляцию осуществляют в погруженном состоянии, или 2-3 дня, если ино- Зкуляцию осуществляют на поверхности с помощью агара, клетки достигают своих максимальных размеров через 3 дня.В случае использования бродильного чана в погруженных условиях разведения в 40последний вводят жидкую питательную среду и стерилизуют, при этом глюкозу вводяттолько после стерилизации других компонентов чана, Из погруженной среды берут посев и вводят в бродильный чан. который выдерживают при температуре роста микроорг анпзма, например при 25 о С, Разведениепроводят при перамешивании с помощью смесителя со скоростью, достаточной для нор -мального обеспечивания питательной среды Эъкислородом.Получаемый протеолитический фермент,свертываюший молоко, выделяют из водногораствора при выращивании на поверхностипутем промывки микроорганизма солевым 5раствором хлористого натрия, содержащим9,0 г КаС 1 на 1 л воды.При выращивании в колбе или бродильном чане фермент выделяют путем декантации, фильтрации или центрифугирования с по- р1,0;0,06; 0,06; следующим сбором остаточного водного раствора, содержащего фермент, Водный раствор фермента подвергают медленному замораживанию, затвердевшую фазу отделяют исобирают остаточную жидкость путем смешиванияее с буферным раствором, рН которого способствует активности протолитического фермента,Для получения чистого продукта протеолитический фермент отделяют от концентрированного раствора путем осаждения, длячего готовят новый водный раствор этихпротеинов и разделяют его хроматографи -ческим методом.Получаемый фермент разрушает фенилаланиново-метиониновую связь пептидной цепикаппа-казеина, оказывая на молоко коагулирующее действие.П р и м е р 1. Культуру выращиваютв погруженном состоянии из микроорганизмовРЪЧ 5 ОРитп 063 сЕр 13060 тп полученного вШвейцарском научно-исследовательском институте рака (Лозанна, Швейцария) в 15 лбродильном чане, на питательной среде состава, вес. %:Глюкоза 1,0;Экстракт дрожжей 0,15;Гидролизат казеина(триптон)СаСЮ 22 Н 20КН Р 04 0,2;М 60 7 Н 0Ре СО 24 Н 20 О, 006;М"СЕ 24 Н 20 О, 0085;Хп бО7 Н 0фО, 0035;Ли"лонная кислота 0,35;Гематин 0,0005;Вода (водопроводная) Баланс до 100%,В бродильный чан вводят 8 л водногораствора указанной питательной среды (кроме глюкозы и гематина), Раствор стерилизуют, подогревая его до 121 оС под давлением в течение 15 мин. Глюкозу растворяют в воде из расчета 50 г на 1 л и стерилизуют. Затем раствор в бродильном чанеохлаждают до 25 оС и в чан вводят стерильный водный раствор глюкозы, устанавливают рН смеси 4,5 водным раствором едкогонатрия, а затем добавляют гематин, предварительно стерилизованный при 120 оС в течение 15 мин в водном щелочном растворе.После этого в питательную среду вносят 2 лпосеВа, полученного путем выращивания в колбах в погруженном состоянии в течение 2 днеймикр оплазмодия Р Ъ у 5 аи тп р оч с е р пац тпПитательную среду перемешивают мешалкой536757 па-казеин. ЦНИИПИ Заказ 5766/270 Тиоеж 575 Подписное Филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 со скоростью вращения 150 об/мин для обеспечения среды кислородом и выдерживают при 25 оС. Выращивание микроорганизма проводят 20 час, получая бульон для культуры микробов, содержащий в сухом виде 1 вес,% клеточного вещества.Микроплазмодий РЗччбсхгитп роЬсе рйа Сцтп отделяют от водной питательной среды центрифугированием и собирают всплывшее на поверхность вешесгво, после чего измеря- щ ют протеолитическую активнэсть всплывшего продукта по метэду "Азэколь",Метод "Азокольф заключается в воздействии раствора, протеолитическую активностькоторого измеряют на субстрат 1 фАзоколь"),состоящий из нерастворимого порошка, изготовленного из кожи коровы, и содержащийярко-красный краситель. Субстрат "Азокольфсуспендируют в 0,05 М буферном растворе 20ацетета при рН 4,5 из расчета 25 мг "Азоколя" на 5 мл буферного раствора. Всплывающее вещество добавляют в количестве,заданном для этой суспензии; смесь выдерживают при 37 оС 15 мин, затем субстрат 25удаляют фильтрацией и измеряют оптическую плотность полученного раствора придлине волны 510 нм,Измеряемую по этому методу единицу ЗОактивности определяют как количество всплывающего на поверхность вещества, вызывающего увеличение оптической плотности единицы. Протеолитическая активность всплывающего вещества составляет 0,7 ед/мл.Полученный продукт имеет следующиехарактеристики,Максимальная протеолитическая активность проявляется при рН 4,0 - 5,0 и уменьшается на 15% от максимальной при рН 7, 4 ОПротеолитическая активность постояннапри 0-30 оС, а затем уменьшается и при60 оС практически равна нулю,Коагулируюшее действие на молоко: смесьпри 37 оС, имеющая ревые обьемы всплывающего вещества и снятого молока и содержащая 12% твердых веществ, вызываетсвертывание молока за 10 мин,П р и м е р 2. Всплывающее на поверхность вещество, полученное в примере 1,концентрируют путем замораживания, длячего его охлаждают, вызывая затвердевание,Незамерзшую фракцию собирают, смешивают с 0,05 М ацетатным буферны:,1 раствором,имеющим рН 4,5 и получеют 1,5 л концентрированного раствора с протеолитпческойактивностью, измеренной по методу "Азоколь" аналогично примеру 1, составляющей3,5 ед/мл.Затем осаждают протеинь 1 из концентри -рованного раствора сульфатом аммония иобразовавшийся осадок отделяют центрифугированием, Осадок растворяют в 0,05 Мацетатном буферном растворе при рН 4,5 идиализуют этот раствор 24 час от этогобуферного раствора,Полученный раствор фракционируют с помощью хроматографии путем прохождениячерез колонну диэтиламино-этилцеллюлозы,уравновешивают 0,05 М ацетатным буферным раствором, содержащих: хлорид натрия,децииормальной концентрации, Элюпрован:.:.фермента выражается тремя лпкамп интелсивной протеолитической активности, Фракции, соответствующие этим пикам, с;бира 1 от,Далее сравнива 1 от действие реннпне икаждой из элюпрованных фракций на каппаказеин, причем при добавлении карбоксипептидазы А фенилаланин освобождается и можно определить его кэличество. Однако добавление только карбоксипептидазы не вызывает выделения фенилеланина,Таким образом, действие реннпн схоа 1 чос действием получаемого фер 51 ентне к. -Формула изобретения 1. Способ получения молокосвертывающего фермента путем культивирования микроорганизмов, продуцирующих фермент, не питательной среде, содержащей источники уг - лерода, азота и минеральные соли, в аэробнь 1 х ус;1 овиях с последуюшп; выделенпем фермента из той среды, о т л и ч,. ю ш;1 йс я тем, что в качестве миерооргае 111 з.ов, продуцируюшпх молокосверть ваът",1:ер- МЕНТ, 11 СПОЛЬЗУ Ют РКУ 501 Гитл РэтЧСЕЪМГЦТП.12, Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что из микроорганизмов РЬуВэ 1 Гтп роЬс ара 1 цтп используют штамм 491. 6 1.Источники информации, принятые во вни - мание при экспертизе:1, Патент Англии Лс 1777051, л С 3 НЗ, от 07, 01. 1970 г.