Способ получения высокоурожайных клонов миксо-и парамиксовирусов

)Л,И. и дрСравние клеточной реакти вирусом гриппаы вирусологии,82.а Г.И. Применение ой рекомбинации дх штаммов вирусавирусологии", 1 ототип) . ОСУДАРСТБЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(71) Всесоюзный нский институт гри(56) 1. Неклюдовательное определенности при инФекциА(ГЗН 2). - "Вопро1976, 3, с. 276-22. Александровметода генетическполучения вакцинньгриппа. - "Вопрось4, с. 387-395 (пр(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОУРОЖАЙНЫХ КЛОНОВ К 1 КСО- И ПАРАИИКСОВИРУ"СОВ путем заражения клеточной культуры вирусными штаммами, инкубированияс последующим титрованием, анализомантигенной структуры и отбором высокоурожайных вирусных клонов, о т л и,ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюускорения процесса, заражение осуществляют с множественностью инФекции1-100 ИЛ , на клетку, инкубируютв течение 4-12 ч, затем повторно заражают клеточную культуру отобранным порезультатам титрования на куриныхэмбрионах вирусным клоном, отбираюткультуральную жидкость, реклонируютее на куриных эмбрионах и затем выбирают высокоурожайный вирусный клон.в осуществлении. Целью изобретения является ускорецие процесса.Цель достигается тем, что согласно способу получения высокоурожяйных клонов миксо- и парамиксовирусовпутем заражения клеточной культутывирусными штаммами, ицкубированияс последующим титровянием, анализомЗОантцгенцой структуры и отбором высокоурожайцых вирусных клонов, заражение осуществляют с множественностьюинФекции 1 в 1 ИД 5 на кпетку, инкубируют в течение 4-12 ч, затем повторно заражают клеточную культуруотобранным по результатам титровацияна куриных эмбрионах вирусным клоном,отбирают культуральную жидкость, реклоцируют ее на куриных эмбрионахи затем выбирают высокоурожяйныйвирусный клон,Способ осуществляется следующимобразом,Клеточную культуру заражают массивной дозой одного вируса (1 -100 ИД /клетку), по завершении этабопа адсорбции - проникновения вирусав клетки - проводят многократнуюотмывку культуры буферным растворомили средой, затем в зараженную культуру вносят питательную среду, культуру ицкубируют при 37 С, начиняяс 4 и до 12 ч, после зарал:ения(в течение первичного цикла репликации) извлекают пробы культуральной 5-жидкости, этот материал клонируютпредельными разведениями на куриныхэмбрионах цли методом бляшек на кле 45 11094Изобретение относится к вирусоло-.1 ни й может бьггь использовано при г 1 оДготовке вакцинных и диагностических штяммов вирусов.Известен способ повышения репро 5 дукции вирусов гриппа путем последоваФельного многокрятното пассироваЙия вируса в исследуемой культуре Г.13Однако по этому способу только часть штаммов вируса григ,па адаптируется к клеточным культурам.11 аиболее близким к изобретепию является способ получения высоко- урожайных клонов миксо- и пярямиксовирусов путем заражения клеточной культуры вирусными штаммами, ицкубирования с последующим титрованием, анализом антигенной структуры и отбором высокоурожайцых вирусных клопов Г 23Однако известный способ сложен 35точных культурах для выпелсция вибрионов, дякпцих вирусное потомствос наиболее высокой репродукционнойактивностью. Полученные субпопуляпииоднократно реклонируют.П р и м е р 1, Получение высоко- урожайного клона вируса гриппа Л (Ленинград) 385/80 для приготовления опытных серий гриппозной тканевой вакцины.В качестве исходного материала для получения высокоурожайного для клеточной культуры из почек телят вирусного клона использовали вакцинный штамм А(Ленинград)385/80, предназначенный для производства инактивировацной аллантоисной гриппознойвакцины.Клеточную культуру из почек телят, выращенную ня 10 пробирках в среде Игла с 107,-ной сыворотки крупного рогатого скота, однократно отмывалисредои 1",тчя от сь 1 вороки Биртс(титр".АМИД /0,2 мл) в 10 раз разводили средой Игла, Клеточные культуры заряжали разведенным вирусом (по1 мл на пробирку, множественностьинфицирования - 10 ЭИД /клетку)и помещали в термостат при 37 С.Через 1 ч вирус удаляли культуры отмывали трижды теплой средой Игла(по 5 мл) от не адсорбировавшегосявируса, после чего вносили ту жесреду (по 1 мл) и культуры помещалив термостатЧерез 2,4,.б,8 и 10 ч после заражения собирали Формирующиеся субпопуляции вируса. Для этого ца указанных сроках культуряльную жццкость из 10 прсбирок полностью отсасывали, а в пробирки с культурой вносили по 1 мл свежей теплой среды,. Собранные популяции подвергали титровациюна куриных эмбрионах с 10 " до 10 , используя по 5-30 эмбрионов на каждое разведение. Исходный заряжающий вирус титровали с 10 1 до 10 "1, Результаты титрования учитывали через +8 ч инкубации куриньгх эмбрионов при 37 С.Первичный учет зякл 1 очался в определении присутствия гемагглютининов в каждом из зараженных эмбрионов. Содеажацие инфекционного вируса в субпопуляцих, собранных через 2,ч, б,8 и 10 ч после заражения состяви ло ,2; 5,.2; А,1; 2,8; и А,.2 ЭЛ / ,/О, 2 мл, Первичный цикл оепрод 5 кции с выходом инфекциоццо 1 о потомства/0,2 мл),Для определения репродукционнойактивности вирусов в составе исходной популяции и субпапуляции вновьсФормированного вирусного потомствадополнительно определяли титры ГАв положительных по РГА. пробах аллантрисной жидкости, собранной из кури Оных эмбрионов, зараженных вирусомв дозе 10" и 10 ЭИД 0.Наиболее репродуктивные вирионы(титр ГА - 1:2048) содержались исключительно в 4 в и 6-часовых субпапуляцих и не обнаруживались при тех жеусловиях в составе исходного вирусаи 8-10-часавых субпопуляций, Дляполучения чистых клонов пробу вируса с титром ГА 1:2048 из 4-часовой 20субпопуляции подвергали реклонированию на куриных эмбрионах. В результате реклонирования содержание высокорепрадуктивных частиц в полученнойсубпапуляции резко повысилось (9 Е 25куриных эмбрионов содержали вирусс титром 1:2048, 17,8 Х - с титром1;4096)Использование полученных высокорепродуктивных клонов для заражения ЗОклеточной культуры из почек телятпозволило повысить титры ГА с 1:321; 128 до 1: 128-1: 1024, инфекционного вируса с 7,8 до 9,3 К ЭИД 0//0,2 мл. Иа материале повторных 130.35наблюдений рассчитаны средние геометрические титры инфекционного вирусаи гемагглютининов, Формирующихся после заражения клеточных культур исходным вирусом и высокорепродуктив Оным клоном, полученным в результатеразделения исходной популяции по скоростям репродукции. Титры гемагглютининов при использовании высакорепродуктиВных клОнОВ пОВышались В среднем 45в 2,3 раза, инфекционного вирусав 31,6 раза.Вся процедура получения высокоурожайного клона заняла 8 суток,в том числе: первичное заражение клеточной культуры вирусом, сбор субпопуляций и их титрование на куриныхэмбрионах (1 сут); инкубация зараженных эмбрионов при 37 С (2 сут); Учетрезультатов титрования и отбор высокоуражайных "скоростныхвирионоввируса (1 сут); повторное заражениеклеточной культуры высокоурожайнымклоном и рекланирование собранной культуральнай жидкости ца куриныхэмбрионах (3 сут); учет результатов иотбор высакауражайцых клонов (1.сут),Итого 8 сут.Полученный высакарепрадуктивныйклон использован для полученич 65 лвирусной биомассы в клеточной культуре 1 П в целях изготовления опытныхсерий тканевай ицактивированной гриппозной вакцины.П р и и е р 2. Получение высокоурожайного клона вируса гриппа А(Техас)1/77 для приготовления тканевога гриппозного диагнастикума.Клеточную культуру 1 ПСК, выращенную на поверхности 4 матрасов емкостью 100 мл, заражали по 1 мл вируса в разведении 1;10, содержавшем10 ЭИД /клетку. Через 1 ч после60заражения вирус удаляли, культуры3 раза отмывали фосфатным буфернымраствором (па 10 мл), на монаслойнаносили гипериммуцную гамалогичнуюкрысиную сыворотку (титр в Р 1 ГА1:1280) па 1 мл В разведении 1:20.Через бО мин ицкубацци при 37 Ссыворотку удаляли, манаслой триждыотмывали ат антител буферам, в каждый матрац вносили по 10 мл поддерживающей среды Игла. Через каждыйчас В течение первых 10 ч репликации,а также через 24, 48 и 72 ч послезаражения из матрасов отбирали по0,5 мл вируса, гомологичные пробыобъединяли и использовали для титра"вания вируса на куриных эмбрионах(с 10 -" до 10), Отобранное из матрасов количество среды восполнялидобавлением аналогичного объема(0,5 мл) среды Игла, культуры вновьпомещали в термастат,Содержание вируса в культуральнойжидкости в интервале 2 - 7 ч составляла 1,7-2,5 д ЭИД0,2 мл. Отчетливое увеличение инфекционных титров(высвобождение вновь сформированноговирусного потомства вследствие завершения первичного репликативногоцикла) отмечено через 8 ч после заражения (4,6 9 д ЭИД 5, /0,2 мл). Определение репродукционной активностивирианов в субпопуляциях вируса, полученных ца разных стадиях репликативнаго цикла, показало, что высокорепрадуктивцые частицы удается обнаружить В составе 8-часовой пробы(время завершения первичного реплика.тивнога цикла) и 10-часовой пробывируса (вскоре после завершения цик 1109435ла) в 11 и 16,7% от общего числа зараженньв( эмбрионов, Высокорепродуктинные частицы не удалось Обнарутлть ни в одной из 6 проб, собранных до завершения цикла репродукцгп 1 вируса Л(Техас)1/77 в клетках ИДСК, а также на более поздних стадиях репродукции (24, 48, 72 ч после заражения). В результате реклонирования 8-часовой пробы на куриных эмбрионах полу че 1 зысокоурожайный скоростной клон вируса Л(ехас) 1/77.Изучение стабильности признака вьгсокой репродуктивности пог:ученцо-. го кло га вируса проведено на 10 5последовательных пассажах вг;руса,выполненных на куриных эмбрионах ив клетках 11 ГСК, Признак высокой репродуктивности сохранялся на протяже.ггци 10 пассажей. Средний геометричсс. рокиц титр гемагглютининов скоростно-.го варианта выше по сравггенг(го с исходным в 3,5 раза, инфекционного вируса - в 99,3 раза при репродукции в клеточной культуре Е 1 СК, цспользо - 25 ванной г, качества системы для раэде,гО 1 гця ИОпу 5 гяци 5 по скорост 51 м репро дукцггц. Показатели репродукцгги скоростнсго" варната вируса Л(Техас) 1/77 и г(уриных эмбрионах цовьшгалц(.ь по отггошению к исходному вирусу в 2 раза по титрам ГЛ и в 8,9 раз по инфекционной активности,Полученный высокорепродуктцвный клон вируса гриппа Л(Техас)1//7 начи 35 ная с 1980 г используется для приготовления тканевьгх гриппозных дцагностгц(умов в отделе экспериментальных препаратов В 11 ИИ гриппа в целях обеспечения диагностической работы опорньгх баз Вс.есоюзного и Регионального центров по гриппу, За этот период подготовлено 36220 мл тканевьг гриппозны.( дцгцостикумов с титром в РГЛ 1:64 - 1:104 и титром в РСК - 1;8 -1:32.П р и м е р 3. Клеточную культуру ,11 стройтзаражали парагриппоэным вирусом 3 типа при множественности инфекции 1 ГИД/клетку. Через 2 ч адсорбции при 37 С вирус удаляли, культуру обрабатывалц иммунной сывороткой к вирусу парагриппа 3 типа (30 м 51 Н при 7 С), после сыворотку удал 511 ц монослой трижды Отмы 1 га 1 иг Фосфатцым буФером, в культуру вносигц лондер(ивающуго среду Игла. (1 ерез 6, 12, 18 и 24 ч после заражения отбирали пробы культуральной жцдкости, содержащей вновь сформированное вирусное потомство, которое титровали методом пляк, С этой целью десятикратными разведениями вирусов (популяции через 6-24 ч после заражения) эаражалц культуры клеток, выращенные на боковой стенкс 50 мл матрацев, Через час инкубации при 37 С вирус удаляли, монослой покрызали первым агаровым покрытием, включаюшим среду 199, ,0,9% агарсзу и 2,5% обезжиренное молоко. Через 4 сут инкубациц при 37 С н инвсртированном положении на монослой наносили второе:(расящее агаровое покрытие, состоя- иее из 0,9% агарозы и нейтрального красного (1."7500), Рсакцию учитываги через 1 сут инкубацци культур прц 37 С. Определяли количество и размер бляшек.Инфекционные титры в пробах через 6, 2,18 и 24 ч после заражения состг,ляц 0 10 з 9 0 з -, 10 Гг 115 о /05 мл соответственно. При этом в 12 и 18-часовых пробах содержались вири. оны, Формирующие наиболее крупные бляшки, диаметром 3-3,3 мм (соответственно ь 15,2 и 6,5% от общего чис;га бляшек), Таких вирионов не удавалось обнаружить при титровании проб, полученньг на более поздних сроках культивирования (24 ч ц позже). Реклонирование крупнобляшечных вариантов показало, что этот признак насле. дуется генстически. Сравнегпе репродукционной активности крупно, средне и мелкобляшечных вариантов показало, что крупнобляшечный вариант ШБЗ и его производньгй Ш-ОБЗ, получен. ный в результате реклонцрования виру; са, обладают повышенной репродукциОнной активностью (ти ры ищ 1 екционного вируса 6,2-6,6 1 БОЕ/0,5 мл по сравнению с 4,2-5,7 г 5 БОЕ/0,5 мл у исходного вируса и 4,0 д БОЕ/ /0,5 мл у среднебляшечцого варианта) . Мелкобляшечггые варианты обладали редуцированной способностью к репродукции ( 0-2,0,0 с БОЕ/0,5 мл), Таким образом, крупнобляшечные клоны пара- гриппозного вируса 3 типа, выделяемые исклюгите 51 ьно из ранних субпОпуляций вируса, обладагот повышенной репродукционной активностью,целяет целесообразность их использованця для изготовления парагриппозных антигенов и дцагностцкумог,Предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает значительное1109435 Составитель А.МаныкинРедактор С.Патрушева Техред Т.фанта Корректор С.Шекмар Заказ 6003/18 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 сокращение времени получения высокоурожайных клонов миксо- и парамиксовифсов, что в условиях массового производства вакцин и диагностикумовдает существенный экономический .эффект.