Способ определения иммунологического состояния организма

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН ИСАНИЕ ИЗОБРЕ по. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ Н АВТОРСНОФЮ СВИДЕТЕЛЬСТ 211 3429198/2 д(,56) 1. С 1 п 1 са 1 ехрег 1 шепйа 1 Лаюш1 ояу 1976, 25, У 2, 319-327.2, Бюллетень экспериментальнойбиологии и медицины, 1976, В 2,с. 197-200. 1,541(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИМИУНОЛО. ГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА, включающий выделение лейкоцитов седиментацией в желатине, добавление эритроцитов, инкубирование, фиксацию и подсчет роэеткообраэующих клеток, о тл.и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, вццеление лейкоцитов осуществляют путем центрифугирования крови при 4-5 е в течение 5-25 мин, а инкубацию с эритроцитами проводят при 4- 12 С в течение 28-30 мин.оИзобретение относится к медицинеи может быть использовано как дляанализа Т-В н А-клеточных систем уздоровых людей, так и для диагностики заболеваний (первичных и вторичных нммунодефицитов),Известен способ определения Т- иВ-популяцийлимфоцнтов периферической крови человека путем розеткообразования (РО) с эритроцитами барана 10или мыши соответственно, включающийвыделение моноядерных клеток градиентным центрифугированием крови нагипак-фнкелле при 400 я в. течение50-40 мин, отмывку клеток, смешение 15полученной суспенэии клеток с суспен.зией эритроцитов из расчета 50 -100 эритроцитов на одну клетку с добавлением 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки, инкубацию смеси в 20течение 5 мин при 37 С, центрифугиорование при 100-150 я в течениео5 мин и инкубацию при 4 С в течение18 ч с эритроцитами барана или при22 С в течениеч для РО с эритроциотами мыши споследующим подсчетомколичества розеткообраэующих лимфоцитов в гемоцитометрах 1.Однако данный способ требует больших затрат времени, что делает невозможным его применение в клинике,не является универсальным, так какне позволяет определять РО другимиклетками, кроме того, является мало.чувствительным к изменению функционального состояния клеток при патоло-З 5гиях.Известен также способ определенияТ-клеток, который включает выделениелейкоцитов из крови после добавленияс 40желатины путем расслаивания в,течене40-50 мин (седиментация эритроцитовпри 1 д), трехкратную отмывку клетокс добавлением перед второй отмывкойдистиллированной воды на 15 с, приго;45давление клеточной суспенэии, содержащей 210 клеток в 1 мп, смешениеЬсуспензии с равным объемом 0,4 Х-нойвзвеси эритроцитов барана, инкубацию.при 37 С в течение 5 мин, центрифуогирование при 200 я 5 мин, инкуба" фцию при 12 С в течение 1 ч ,выдерживание с глутаровым альдегидомв течение 20 мин, отмывку от глутарового альдегида, приготовление и окраску мазков и подсчет количества 55розеткообразующих клеток Я ,1Однако данный способ также требуетзначительных затрат времени и включает большое число манипуляций, чтозатрудняет его широкое использованиев клинике, кроме того, является недостаточно чувствительным к изменениюфункционального состояния клеток.Целью изобретения является повыше"ние чувствительно ти и упрощение способа,Укаэанная цель достигается тем,что согласно способу опрЕделения иммунологического состояния организма,включающему выделение лейкоцитов кро"ви седиментацией в желатине,добавление эритроцитов, инкубирование, фиксацию и подсчет розеткообразующихклеток, выделение лейкоцитов осуществляют путем центрифугирования при 45. в течение 15-25 мин, а инкубациюс эритроцитами проводят при 4-12 С .втечение 28-32 мин.Способ осуществляют следующим образом. К генаринизированной периферической крови (20-60 ед. гепарина на 1 мл крови) добавляют ЗХ-ный раствор жела- тины на физрастворе в количестве 1 мл на 3 мп крови и центрифугируют при 4-5 я 15-25 мин. Верхний, лейкоцитарный слой собирают в центрифужную пробирку и измеряют его объем. Добавляют среду Хенкса до общего объема 10- 11 мл, центрифугируют при 400 я 10 мин, а надостаточную жидкость сливант. Осадок ресуспендируют, добавляют к нему 1 мл дистиллированной воды, взбалтывают, а через 15 с приливают среду Хенкса до объема 10-11 мл. Центрифугируют при 200 я 10 мин, насадочную жидкость сливают. Осадок ре- суспецдируют, добавляют к нему среду 199 из расчета 0,8 мл на 1 мл лейкрцитарного .слоя, О, мл полученной суспензии смешивают с 0,6 Х-ной взвесью эритроцитов (для определения РО.с зрит. роцитами мыши в смесь добавляют 0,05 мп эмбриональной телячьей сыворотки) смесь центрифугируют при 200 я 5 мин и инкубируют при 4-2 С 28-30 мин. Затем осадок ресуспендируют, добавляют к нему 0,05 мп ЗХ-ного раствора глутарового альдегида в фосфатном буфере, выдерживают 5-6 мин и приливают 10 мл дистиллированной воды. ЦентриФугируют, надосадочную жидкость слива ют, а из осадка готовят мазки. Мазки сушат на воздухе, окрашивают и подсчитывают количество РОК для всех ви;. дов клеток крови.1090409 3П р и м е р 1. Берут 6 мл крови в пробирку, содержащую 0,6 мл раствора гепарина на Физрастворе (200 ед. в мл), добавляют 2 мл 37.-ного раствора желатины, перемешивают и центрифугиру 5 ют при 5 и 25 мин. Верхний слой. собирают в центрифужную пробирку. (получено 2,3 мп верхнего лейкоцитарного слоя), Приливают среду Хенкса до объема 11 мл, центрифугируют при 400 я О О миц. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Приливают 1 мл дистиллированной воды, выдержива ют 5 с, Затем добавляют среду Хенкса до 11 мл и центрифугируют 10 мнн при 200 я. Надосадочную жидкость сливаютОсадок ресуспендируют и добавляют к нему 2,5 мл 199. среды. О, мп полученной взвеси клеток смешивают с 0,1 мл 0,6 Ж-ной суспензии эритроци О тов барана. В другой пробирке смешивают 0,1 мл полученной взвеси клеток с О,б -ной суспензией эритроцитов мыши (О, 1 мл) и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки инактивирован 5 иой адсорбированной),Центрифугируют при 200 я 5 мин. Инкубируют при 4 Со 28 мин, Осадки ресуспендируют, добавляют к ним 0,05 мл 37-ного раствора глутарового.альдегида, выдержива ют 5 мин. Затем в пробирки наливают по 6-10 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 200 я 5 мин, надосадочную жидкость сливают, Готовят мазки, сушат на воздухе. Препараты З 5 фиксируют в метаноле, окрашивают метиловым зеленым - пиронином, подсчитывают количество лимфоцитарных розеток на 100 лимфоцитов и нейтрофиль.ных розеток на 100 нейтрофилов. 40 П р и м е р 2. Берут 3 мл крови в центрифужную пробирку, содержащую 0,6 мл гепарина (207 ед. в мл) имл 37-ного раствора желатины переФ45 мешивают. Центрифугируют при 4 я 15 мин. Верхний алой в количестве 1,5 мл собирают в центрифужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема 1 мл, центрифугируют при 400 я 10 мин, Надосадочнуюжидкость сливают;. осадок ресуспендируют. Приливают 1 мп дистиллированной воды, выдерживаютЪ15 с. Затем добавляют среду Хенкса до 11 мл, центрифугируют при 200 я 10 мин.Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к не-, му 1,2 мл 109 среды, 0,1 мл полученной взвеси клеток смешивают с О, мл 0,67-ной суспензии эритроцитов барана, а в другой пробирке - с 0,1 мл 0,67-ной суспензии эритроцитов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки, Центрифугируют при 200 яо5 мин, Инкубируют прнС 30 мин. Далее - так же, как в примере 1.П р и.м е р 3, Берут 3 мп крови в центрифужную пробирку, содержащую 0,3 мл,гепарина (200 ед. в мл), добавляют 1 мл ЗХ-ного раствора желатины, перемешивают, Центрифугируют при 4-5 д 20 мнн. Верхний слой в количестве 1,5 мп собирают в центрнфужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема 11 мл, центрифугируют при 400 д 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Приливают 1 мл дистиллированной воды, выдерживают 15 с. Затеи добавляют среду Хенкса до 11 мл и центрифугируют при 200 я 10 мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему 1,2 мл среды 199. 0,1 мл полученной взвеси клеток смешивают с 0,1 мл 0,6 Х-ной суспензии эритроцитов барана, а в другой пробирке - с 0,1 мл 0,67-ной суспензни эритроцитов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Центрифугируют прн 200 5 мин. Инкубируоют при 12 С, 30 мин. Далее - так же, как в примере 1. П р и м е р 4 (контрольный). Берут 6 мл крови в пробирку, содержащую 0,6 мл раствора гепарнна (200 ед. в мл), добавляют 2 мл 37-ного раствора желатины, перемешивают и выдероживают прн 37 С 40 мин. Верхний слой собирают в центрифужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема 11 мл, центрифугируют при 400 п О мнн. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспенднруют. Приливают 1 мл дистиллированной воды,вы. держнвают 15 с. Затем добавляют среду .Хенкса до 11 мл и центрнфугируют при 200 я 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, Осадок ресуспендируют, добавляя к нему 11 мл среды Хенкса и центрифугируют лри 200 я 10 мин. Надосадочную зидкость сливают. Готовят суспензию клеток, содержащую 2 10б клеток в 1 мл среды 199. 0,1 мл полученной взвеси клеток- смешивают с 0,5 мл 0,47-ной суспензии эрнтроцитов барана. В другой пробирке 0,1 мл взвеси клеток смешивают с 0,1 мл1090409 личия при сравнении с группой здоровых более 99%). При исследованииэтих же групп по прототипу различиямежду группами в большинстве случаев 5 были недостоверны, т, е, достоверностьразличия была менее 95%. Споссб Объект исследования Предлагаемый Прототип Лимфоциты Нейтрофилы Лимфоциты Нейтрофилы Здоровые доноры(25 чел.)РО с эритроцитамибарана (Е-РО) 70,7+1,3 33,2+1,6 64,7+1,5 29,9+2,2 РО с эритроцитамимыши (М-РО) 16,5+1,0 12,6+1,3 14,8+0,9 9,9+1,1 Больные острой пневмонией (25 чел.)Е-РО 24,3+1,6(Р ( 0,05) М-РО 0,5%-ной суспензии эритроцитов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки, Смесь инкубируют при 37 С 5 мин, а затем центрифугируют при 2008 5 мин. Инкубируютпри 12 С 60 мин. Осадки ресуспендируют, добавляя к ним .0,05 мл 3%-ного раствора глутарового альдегида, выдерживают 20 мин, Затем в пробирки наливают 8-10 мл дистиллированной воды, центри о Фугируют при 200 я 5 мин, надосадочную жидкость сливают. Готовят мазки, сушат на воздухе. Препараты фиксируют в метаноле, окрашивают метиловым зе" леным - пиронином, считают количество розеток на 100 клеток.РО клетками периферической крови представлено в таблице.Данные, приведенные в таблице, показывают, что предлагаемый способ О по сравнению с прототипом более чувствителен к изменениям функционального состояния клеток у здоровых и больных. Это подтверждается тем, что при исследовании групп больных предлагаемым способом возрастает, достоверность различия показателей, цолученных для групп больных в сравнении со здоровыми донорами. Так, нри исследовании групп больных ост рой пневмонией и раком гортани в сравнении с группой здоровых доноров предлагаемым способом достоверность различия почти всех показателей более 95% (для Е-Ро нейтрофилов у боль-З 5 ных раком гортани достоверность разТаким образом, повышение чувствительности подразумевает возможность четкого определения изменений функци ональной активности клеток у больных в сравнении со здоровыми, а значит, более надежного определения иммунодефицитов или состояния повышенной функциональной активности. Такое повышение чувствительности способа дос тигается за счет более быстрого выделения клеток, на которое уходит 40- 50 мин вместо 80-90 мин.по прототипу, что уменьшает вероятность травмирова ния клеток и способствует сохранению такого функционального состояния клеток, какое было в крови; уменьшение времени инкубации после центрифугиро. вания с 60 (прототип) до 28-32 мин учитывает динамику РО : если клетки имеют нормальную Функциональную активность (у здоровых),то РО завершается на 20-25 мин инкубации, далее количество розеток не изменяется. Если клетки имеют низкую функциональную активность, то РО проходит медленнее, за 60-90 мин, и инкубация в течение 28-32 мин позволяет более четко установить уменьшение Функционапьной активности.090409 Продолжение таблицы Объект нмсследования Способ Предлагаемы Лимфоцнты Нейтрофилы ЛимФоциты Нейтрофилы 15,1+1,9. П.р и м е ч а н и е: Р - достоверность различия средних значений показателей.в группах больных по сравнению с группойцоровьж, полученная с использованием таблицыСтьвдента. Составйтель Г.КрюковаТехред С.Легеза Корректор В.БутягаФюв Редактор Г. Гербер Заказ 2976/7 Тираж 688 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРно делам изобретений и открытий113035, Москва, 3-35, Рауаская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Больные раком гортани (22 чел.)Е-РО 55,6+1,2