Способ подбора донора при трансплантации трупных тканей опорно-двигательного аппарата

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН З(59 А 61 К 39/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛЬСТВ вательс олучение,ых реакния при гемо дело К. Опе чау суСе сц 1 йц - 547,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ 1 ТИЙ. кий институт ортопедии(56) 1. Зотиков Е.А. и др. Пхранение И применение тестовтивов для тканевого типировааллогенных трансплантациях итрансфузиях. - "Лабораторное1976, У 10, с, 630-638.2. ВасЬ Р.Н., Чоупою И.яС 1 шц 1 ас 1 оп дп ш 1 хео 1 ецсогез 5 с 1 псе, 1966, 153, 545(54) (57) СПОСОБ ПОДБОРА ДОНОРА ПРИТРАНСПЛАНТАЦИИ ТРУПНЫХ ТКАНЕЙ ОПОРНОДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА путем определения дп чуго бластной трансформациилимфицитов периферической крови реципиента на трансплантационные антигеныдонора, о т л и ч а ю щ и й с я ,тем,что, с целью повышения точности способа и сокращения времени селекции,дополнительно определяют макрофагальную трансформацию мононуклеаров.1 1106Изобретение относится к медицине,преимущественно к трансплантационнойиммунологии, и предназначено для селекции донора при трансплантациитрупной, в частности костной ткани.Известен способ подбора донорапо антигенам гистосовместимости припересадке органов и тканей - серологическое типирование при помощи типируемых моноспецифических сыворотокОднако данный способ требует дорогостоящих моноспецифических сывороток.Известен способ подбора донорапри трансплантации трупных тканейопорно-двигательного аппарата путемопределения 1 п чхйго бластной трансформации лимфоцитов периферическойкрови реципиента, при этом используется однонаправленная смешанная куль.тура лимфоцитои (СКЛ), где лимфоциты донора обрабатываются митомицином С или облучается, что делает ихнеспособными трансформироваться вбласты2 3,Однако известный способ менее точен, а кроме того, возможное получение результатов реакции достигаетсятолько на 7 сут.Цель изобретения - повышение точности способа и сокращение времениселекции.Указанная цель достигается тем,что согласно способу подбора донорапри трансплантации трупных тканейопорно-двигательного аппарата путемопределения п чТго бластной трансформации лимфоцитов периферическойкрови реципиента на трансплантационные антигены донора, дополнительноопределяют макрофагальную трансформацию мононуклеаров.Способ осуществляется следующимобразом. Для селекции донора используется принцип однонаправленной СКЛ, где в качестве стимулирующего агента используется лизат лимфоцитов донора - трупа, полученный однократным замораживанием лимфоцитов при -25 - (-35) С без протектора в течение 1 - 12 мес. и однократным оттаиванием при комнатной температуре в течение 1 ч. Селекция донора проводится на основании 55 учета бластной И макрофагальной транс Формации лимфоцитов периферической крови реципиента,508 2П р и м е р 1. Фибринолизнуюкровь берут из сердца трупа до заборакостной ткани в асептических условиях.Для получения лимфодитарной суспензиииз трупной крови эритроциты осаждают57 раствором желатина (на среде 199),которую добавляют в соотношении 1:2,Пробирки помещают под углом 45 на40 мин при комнатной температуре, надосадочный слой снимают. Для осаждения лимфоцитов надосадок центрифугируют при 180 и 10 мин, к осадку добавляют для лизиса эритроциты 0,843раствора хлористого аммония выдерживают при +4 С 5 мин, с последующим центрифугированием при 180 о8 мин, К осадку добавляют 6 - 8 млсреды 199 повторно центрифугируют180 о 10 минут, полученный осадокресуспендируют в среде 199, проводятподсчет лимфецитарных клеток в 1 млв световом микроскопе в камере Горячева при увеличении в 200 раз (дляобеспечения в дальнейшем оптимальногосоотношения стимулирующего агента"отвечающих" клеток).Полученную суспензию помещают вхолодильную камеру при температуре-25 С -35 С на срок 1 - 12 мес. домомента селекции донора и трансплантации костной ткани. Замораживание ихранение лимфоцитарной суспензиипроводят в запаянных ампулах, всеманипуляции - в стерильных условиях.Кровь реципиента берут из локтевойвены натощак, 20,0 мл на гепарине. Вдальнейшем возможна постановка СКЛс. чистой лимфоцитарной суспензией ре.ципиента, либо с его цельной кровью,В первом случае выделение лимфоцитовпроводят по описанной методике. Вовтором случае - в пробирки помещаютцельную кровь в количестве 0,20,3 мл с подсчетом содержащихся вэтом количестве лимфоцитов,В пробирки с культуральной средой(среда 199, Мгла, Зенкса) и аллогеннойАВ (1 У) или ксеногенной (бычьей, телячьей, лошадиной сывороткой) помещают лимфоциты (кровь) реципиента илизат лимфоцитов донора в пересчетена клетки в соотношении 1:3, культивируют культуру 72 ч при температурео37 С, Параллельно ставят контроль(содержащий только клетки реципиента)и реакцию с фитогемагглютинином,Учет - морфологический - подсчитывается процент бластов и микрофаговв каждой культуре (окраска по Рома1106508 Процент трансформированных клеток в СКЛ Контроль (нестимулированнаякультура) Реакция с фи- тогемагглютиДонор нином А(11) А(3 Х) 0(1) А(1 Х) Влас-. Макро- Блас- Макро- Влас- Мак- Влас- Мак ты фаги ты фаги ты рофа- ты роги фа- ги Блас- Макроты фаги Макрофаги Бласты 49 2 13 новскому, считается 300 клеток). Реакция ставится одновременно с несколькими донорскими образцами после того, как клиницист произвел отбор приемлемых трансплантатов от трупов - доно ров из банка консервирования по рент.геновскому снимку и группам крови.В предлагаемом способе культивируют лимфоциты 72 ч, а в аналогах - 168 ч, что сокращает время исследо вания на 96 ч. Применение предлагаемо. го способа не предусматривает сохранение жизнеспособности лимфоцитов донора и поэтому не требует дорогостоящей аппаратуры для программного их замора живания, что удешевляет и упрощает процесс селекции. Учет степени не только бластной трансформации клеток, но и макрофагальной трансформации - вводит дополнительный показатель для 20 оценки совместимости, что повышает точность селекции донора, так как микрофаги являются необходимым звеном в иммунном ответе. Способ пригоден при трансплантации трупной костной 25 ткани, которая по существующему поПри селекции рекомендовано использовать для трансплантации костную ткань от донора 1, с которым в СКЧ минимальная реакция, и не использовать ткани донора 2, давшего максимальную и макрофагальную реакцию,Результаты учета.В нестимулированной культуре лимфоцитов (без добавления донорского антигена) бластов 1%, макрофагов 1 Й). Эта реакция служит контролем при даль. ложению пересаживается в замороженном состоянии не ранее, чем через один месяц с момента заготовки.Способ может быть использован для изучения трансплантационного иммунитета в динамике после аллотрансплантации, так как хранение донорских лимфоцитарных лизатов не представляет трудности. Способ апробирован на 58 образцах крови, из них 50 доноров, 5 реципиентов, 3 клинически здоровых лица (контроль).П р и м е р 2. Больной Щ., диагноз: хронический остеомиелит проксимального отдела правой бедренной кос. ти в стадии ремиссии, сгибательная контрактура в тазобедренном суставе, история болезни У 327233, группа кро ви А (11), резус положительный. Определены клинические показания к трансплантации костной ткани, Проведена селекция донора для реципиента Щ. по предлагаемому способу, ре-зультаты которой представлены в таблице,5 45 5 17 3 20 нейшей селекции донора, как начальнаяточка отсчета. При реакции с фитогемагглютинином бластов 49%, макрофагов 2%, реакция показывает, что реак-,тивность лимфоцитов больного по отношению к митогену снижена. При реакциис лизатом лимфоцитов донора 1, группыкрови 0 (1), бластная реакция 1%, мак.рофагов 13%, отнимаем эти показателиот контрольных - результат указывает,что в этом случае бластной реакции5 1106508нет, а макрофагов - 27 При реакциис донором 2, группа крови А(П), бластов 57, макрофагов 457, отнимаем контрольные значения, т.е, в нестимулированной донорскими антигенами культуре лимфоцитов, в результате: бластная реакция 4%, макрофагальная реакция 34%. При реакции с донором 3,группа крови А (11), бластов 57, макрофагов 177., после сопоставления с 10контролема бластов 4%, макрофагов63, При реакции с донором 4, группакрови А(11), бластов 37, макрафагов20%, после сопоставЛения с контролем:бластов 27, макрофагов 9%, 15Наименьшую бластную и макрофагальную реакции дает донор 1, вследствиечего он и рекомендован для данногореципиента.Наибольшую макрофагальную реакцию 20дает донор Р 2, почему он должен бытьотклонен. Б, случае, если бы проводился выбор между донорами 2 и 3,давшимиодинаковую бластную реакцию 4%, топредпочтение имеет донор 3, с которым 15макрофагальная реакция меньшая - 67.,а не донор 2, с которым макрофагальная реакция 347,. Таким образом, учетмакрофагальной реакции повышает в двараза точность селекции донора. ЗОПовышение точности селекции достигается тем,что среди доноров, давшиходинаковую бластную реакцию, по макрофагальной трансформации можно выбратьболее совместимого на основе подсчетаколичества макрофагов. Тот донор, который при равной бластной дает наименьшую макрофагальную реакцию будет наиболее совместимым, Сокращение времени селекции достигается тем, чтовместо 7 сут н известном способе куль.тивирование клеток производится впредлагаемом способе 3 сут в связис тем, что макрофаги из мононуклеаровтрансформируются раньше, чем бластыиз лимоцитов и максимальная трансформация макрофагов наблюдается через 72 ч, Большое количество макрофагов по сравнению с ничтожно малымколичеством бластов, например 45 мак.роагов пб сравнению С 7 бластами,подсчитывается значительно легче подмикроскопом, а вариабельность колеблется в диапазоне 2 - 45 при макрофагальной трансформации, в пределах2 - 7 для бластной трансформации.Точность способа обеспечивается также и тем, что при бластной трансформации встречаются переходные формыклеток, имеющие признаки общие длябольшого лимфоцита и малого бласта,например большое ядро, но беэ ядрышек внутри него, небольшой ободокцитоппазмы и др., что затрудняетклассификацию клеток. При оценке макрофагальной трансформации эта трудность не возникает,так как макрофагна любой стадии трансформации имеетпризнаки, характерные только дляэтого вида клеток: эксцентрично расположительное ядро, пенистую цито"плазму, в которой имеется вакуолии . включения (фагоцитированиые частицы)аТираж 688 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5