Способ определения т-лимфоцитов

,. -чр. итт ц" и ГЕН Ы 1-.Д Союз СоветскихСоцкалистическихРеспублик ОП ИКАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 11 721084(5) М. Кл,Аб В 0/00 6 01 Х 33/ 6 гГосударственный комитет СССР па делам изобретений и открытийДата опубликования описания 25,03.80(72) Авторы изобретения А. И. Маркявичюс, В. И. Гирюнас, П. Б. Садаускас и В. С. Домкус Институт биохимии АН Литовской ССР и Всесоюзный научноисследовательский институт прикладной энзимологии(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ Изобретение относится к области иммунологии.Известен способ определения Т-лимфоцитов путем центрифуги рова ния крови с последующим отделением мононуклеарных клеток, инкубирования их с эритроцитами барана в среде Хенкса, отделением полученного осадка, ресуспендирования его иподсчета Т-лимфоцитов 111.Однако известный способ не позволяет точно определить Т-лимфоциты.Целью изобретения является повышение10 точности способа.Цель достигается тем, что инкубирование проводят в среде Хенкса, дополнительно содержащей хлорид цинка в концентрации 110 5 - 3 10 5 г/мл среды при 8 - 22 С. 15Пример 1. Выявление Т-лимфоцитов крови у людей. Лимфоциты выделяют из венозной крови. Гепаринизированную (10 ед/мл) кровь (5 мл) разбавляют раствором Хенкса (без Са 2 и Мд 2 - для предотвращения эффекта слипания клеток) в соотношенииго 3: 2. Затем 8,3 мл разбавленной крови осторожно наслаивают в центрифужных стаканах (емкостью 25 мл) над 7 мл раствора,состоящего из 5,2% фиколла 400 и 60% верографина плотностью 1,077. Центрифугирование проводят в центрифуге Кна роторе-крестовине при 900 д в течение 70 мин при 18 С. Мононуклеарные клетки (96% лимфоцчтов), находившихся на границе плазмы крови и фиколла-верографина, отсасывают пастеровской пипеткой, дважды промывают раствором Хенкса (без Са и Мдзф) по 20 мл и дважды центрифугируют при 200 д в течение 10 мин. Полученный осадок клеток ресуспендируют в растворе Хенкса (с Саа и Муз ) с добавлением к нему УпСз в конечной концентрации 1 10г/мл (0,001/о) Жизнеспособность клеток составляет 98 - 100%. Определяют концентрацию клеток и доводят ее до 2 106 на 1 мл.Далее в силиконизированные центрифужные пробирки, содержащие по 1 мл суспензии лимфоцитов (2 10 клеток/мл), добавляют по 0,1 мл дважды отмытых раствором Хенкса эритроцитов барана (хранившихся не более 10 дней в растворе Альверсера при 4 С) в концентрации 108 на 1 мл. В некоторые пробирки добавляют еще абсорбированную сыворотку эмбрионального те-12 ленка. Инкубационную суспензию клеток перемешивают, центрифугируют при 100 д в течение 10 мин и оставляют йа 8" - 20 ч при 8 - 22 С. После инкубирования надосадочную жидкость отсасывают, осадок клеток " ресусйендируют путем осторожного вращения ( 1 об/с) рукой пробирок с наклоном 30 - 45, Суспензию клеток вводят в камеру Горяева или наносят на объективные стекла пастеровской пипеткой, Мазки делац.ют общеизвестным способом, фиксируют абсолютным метанолом и окрашивают по Романовскому-Гимзе.Процент розеткообразующих лимфоцитов определяют просматривая по 200 лимфоцитов. Розеткой считают лимфоцит с прикрепившимися к нему не менее трех эритро: цитов барана.В табл. 1 приведены средние арифметические измерения, стандартные отклонения или нижний и верхний пределы измерений.Таким образом, при инкубировании клеток в среде Хенкса схлоридом цинка колите ". чество выявленных розеток наиболее высокое и в 1,4 - 1,8 раза превышает их число при инкубировании клеток в среде Хенкса, несодержащем хлорида цинка. Пример 2. Выявление Т-лимфоцитов в крови у крупного рогатого скота. Все операции выявления розеток у крупного рогатого скота идентичны методике определения розеток у людей за исключениемтого, что слой мононуклеарных клеток образовался на границе слоев плазмы крови и смеси из фиколла 400-верографина,плотность которого была 1,069 при центрифугировании 1000 д в течение 80 мин.В табл. 2 приведена характеристика розеткообразующих лимфоцитов в крови крупного рогатого скота. Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение в инкубируемую суспензив клеток 1 10- 3 10г/мл (а для лимфоцитов крупного рогатого скота еще и 50% сыворотки) позволяет получить наибольшее количество сохранных розеток как в камере Горяева, так и на мазках, а число прилипших эритроцитов к розеткообразующим лимфоцитам значительно увеличено. Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью определить Т-лимфоциты как у людей, так и у крупного рогатого скота./ 8,0-3,0 5(3-7)56,5 3,5 10( 3-16) 11,5+3,0 59,5+4,5 Среда Хенкса Среда Хенкса с Р се,Среда Хенкса с2 иЩ и 50%сыворотки 6 3 5-4, О 1 2( 3-20) 64,0-3,5 12( 3-19) Среда Хенкса и 50% сыворотки 34,. 0-6,0 7( 3-1 2) 49, О+6,5 6( 314)/ /Составитель С. МалютинаТехред К. Шуфрнч Корректор Ю. МакаренкоТираж 673 ПодписноеЦН ИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Редактор В. ТрубченкоЗаказ 23/4 формула изобретенияЗОСпособ определения Т-лимфоцитов путем центрифугирования крови с последующим отделением мононуклеарных клеток, инкубирования их с эритроцитами барана в среде Хенкса, отделением полученного осадка, ресуспендирования его и подсчета Т-лимфо- Б цитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, инкубирование проводят в среде Хенкса, дополнительно содержащей хлорид цинка в концентрации105 - 3 10г/мл среды при 8 - 22 С.Источники информации,принятые во внимание приэкспертизе1. Яецго 1 оду 1976, 26, 10. с. 997 - 999