Олигомер урокиназы, обладающий фибринолитическим действием, и способ его получения

СОЮЗ СОЮТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЯО 948114(и+ос - (сн,);о ,ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(57) 1. Олигомер урокиназы общейформулы. (У)+ос - (сн,), - огде У - остаток урокиназы;и 2-3;1 и = 1-2УММ 6510 з 96 10 зобладающий фибринолитическим действием. 2. Способ получения олигомераурокиназы общей формулы где 1 - остаток урокиназы;п = 2-3;1 т = 1-2;ММ 65 10-96 10 зобладающего фибринолитическим действием, заключающийся в том, что урокиназу растворяют в О, 10-0, 15 М фосфатном буферном растворе, затем в раствор последовательно вводят глутаровый диальдегид при массовом соотношении урокиназы глутарового диальдегида 5:О, 55-1, 1 и 4,0-5, 43-ный водный раствор тригидроксиметиламино" метана, а целевой продукт выделяют гель-хроматографией.Изобретение относится к олигомерным формам протеазыурокиназы общей формулы 948114Поставленная цель достигается олигомером урокиназы общей формулыу)+ос - (сн)го ,где У, - остаток урокиназы;н = 2-3Уи = 1-2,ММ 65.10 з 96 10 зспособам получения олигомерных форм,сохраняющих ферментативную активность, и может найти широкое при-менение в лабораторной практикедля модельных экспериментов.Известен продукт, полученныйспособом ковалентной иммобилизацииурокиназы на карбокснметилцеллюлоза.,гидразиде,Способ получения этого продукта включает следующие технологические операции:,0,5 г карбоксиметилцеллюлозагидразида суспендируют в 75 мл0,5 М раствора ЯаС 1 и перемешивают 15 мин;к суспензии добавляют 5 мл 5%-ного раствора НаНО и перемешивают 20 мин;выпавший азид отделяют центрифугированием, осадок промывают 1 М раствором ЯаСЙ и бикарбонатным буферным раствором;осадок суспендируют в растворе урокиназы в бикарбонатном буфере;рН суспензии доводят до 8,5 и перемешивание ведут 12 ч при 4 С, затем промывают водой и бикарбонатным буферным раствором;все операции проводят при охлаждении с преднарительно охлажденными реагентами, продукт реакции - суспензия иммобилизованной протеаэы - хранится при охлаждении.Полученная иммобилизованная урокиназа стабильна при 4 С в течение 6 месяцев, за это время она сохраняет 55% исходной активности.Основным недостатком известного способа является получение продукта с низкой (ю 1%) специфической активностью и нерастворимостью.Целью изобретения является получение водорастворимых форм ррокиназы, повышение специфической фибринолити" ческой активности. где У - остаток урокиназы;)1 = 2-3;Из = 1-2,ММ 65 10 з 96 10,10Указанный олигомер является новым, в литературе не,описан.Способ получения олигомера урокиназы общей формулы где- остаток урокинаэы;2-.3Ь = 1-2,ММ 65 10"96 10 , обладающего фибринолитическим действием, заключается в том, что урокинаэу растворяютв О, 10-0, 15 М фосфатном буфере, за 25тем в раствор последовательно вводятглутаровый диальдегид при соотноше-,, нии урокиназы и диальдегида 5;0,55"1, 1 и 4,0-4,5%-ный водный раствортригидроксиметиламинометана, ацелевой продукт выделяют гель-хроматографией.Способ осуществляют следующимобразом. Урокиназу с активностью1000 ед Плоуга/мг растворяют вО, 10-0, 15 М фосфатном буферном раст 35 воре с рН 6,0-6,2 и добавляют 2,02,2%-ный водный раствор глутарового,диальдегида.Смесь перемешивают при 20-22 С10-360 мин при соотношении уроки 40 назы и глутарового диальдегида5: 1,0-1,1.В реакционную смесь добавляют4,0-4,5%-ный водный раствор тригидроксиметиламинометана.45 Полученный раствор с рН 6,0-6,2гель-хроматографируют на сефадексеС, уравновешенном 0,10-0,15 Мфосфатньк буферным раствором срН 6,0-6,2. Элюцию ведут тем же бу 50 ферным раствором.Биологическая активность олигомерной модификации урокиназы изучена при лечении экспериментальнойгифемы животных,55 П р и м е р 1. 10 мг урокиназыс активностью 1000 ед Плоуга/мгбелка растворяют в 3 мл 0,10 М фосфатного буферного раствора с рН 6 О,Иедленно добавляют О, 10 мл 2,2 Х-ного гаутарового диальдегида при соотношении урокиназы и глутарового диальдегида 5: 1, 1. Смесь перемешивают 30 мин, при 22 С к ней добавляют 5 0,10 мл 4,5 Х-ного триокснметиламинометана, Через 10 мин полученную смесь вводят в хроматографическую колонку.(1,5 х 150 см)1 заполненную 300 мл сефадекоа С, уравновешен ного О, 10 М фосфатным буферным раствором с рН 6,0. Гель-хроматографию проводят при 5 С со скоростьюо15 мл/ч. Элюцию проводили 0,10 М фосфатным буферным раствором с 15 рН 6,0.Количество выделенной растворимой олигомерной урокиназы 6,0 мг, что составляет 60 Х от количества фермента, взятого в реакцию. 20П р и м е р 2. 10 мг урокиназы с активностью 1000 ед Плоуга/мг белка растворяют в 3 мл О, 15 М фосфатного буферного раствора с рН 6,2. К полученному раствору добавля ют О, 10 мл 2,0 Х-ного раствора глутарового диальдегида при соотношении урокиназы и глутарового диальдегида 5;1. Смесь перемешивают 120 мин при 20 С, добавляют 0,10 мл30 4,0 Х-ного раствора триоксиметиламинометана. Реакционную смесь гельхроматографируют в условиях примера 1. Элюцию ведут со скоростью 20 мп/ч. Общее количество раствори- З 5 мой олигомерной урокиназы 7,6 мг, что составляет 76 Х от количества фермента, взятого в реакцию.П р и м е р 3. 10 мг урокиназы с активностью 1090 ед Плоуга/мг бел ка растворяют в 3 мл 0,10 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0. К раствору добавляют 0,10 мл 2,0 Х-ного глутарового альдегида (соотноше- ние урокиназы и глутарового альдеги да 5: 1), Смесь перемешивают 360 мин .при 20 С, добавляют 0,10 мл 4,5 Х-ного раствора триоксиметиламинометана. После перемешивания в течение 10 минОпри 22 С реакционную смесь гель-хро матографируют в условиях примера 1 при 5 С со скоростью элюции 15 мл/чОбщее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 9,5 мг или 95 Х от количества фермента, взя того в реакцию.П р и м е р 4. 50 мг урокиназы с активностью 200 ед Плоуга/мг бел Таблица 1 Активность, Х. к исходной. урокиназе При- Выходмер димера , тример, высшие(ММ 65000), (ММ 96000) олигомерыХ (МИ 200000; 21/20 6/5 28/20, 14/10 36/15 21/5 1 32/40 2 34/45 3 38/50 П р и м е р 5. 15 мг урокиназы . с активностью 1000 ед. Плоуга/мг белка растворяют в 5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0, К полученному раствору добавляют 0,075 мл 2,2 Х-ного глутарового диальдегида (соотношение урокиназы глутарового. диальдегида 5:0,55). Смесь перемешивают 2.ч при 20 С.Затем добавляют 0,075 мл 4,5 Х-ного триоксиметиламинометана. После перемешивания в течение 10 мин при 20 С реакционную смеск гель-хроматографируют в условиях примера 1 при 5 С со скоростью элюции 15 мл/ч..Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 9,9 мг или ббХ от количества фермента, взятого в реакцию: из них днка растворяют в 16 мл 0,05 М фосфат. ного буферного раствора с рН 6,0. К раствору добавляют 0,5 мл ,2 Х-ного раствора глутарового альдегида.Смесь перемешивают 60 мин при 20 С, добавляют 0,5 мл 4,4 Х-ного раствора триоксиметипаминометана, После первмешивания в течение 10 минопри 20 реакционную смесь вводят в колонку (Зх 80 см) с сефадексом Сдля отделения олигомерных форм урокинаэы от немодифицированного фермента. Элюцию ведут при 5 С О, 1 М фосфатным буферным раствором со скоростью 20 мл/ч, Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 35 мг или 70 Х от количест" ва фермента, взятого в реакцию. Активность олигомерной урокиназы составляет 20 Х от исходной активности урокиназы.Характеристики олигомерных форм урокиназы приведены в табл. 1.(ММ 200 10 ) Редактор О. Кузнецова Техред С.Мигунова Корректор И. Эрдейи Заказ 1166/2 Тираж 471 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгоод, ул. Проектная, 4 мер 293, трнмер 313, высшие олигомеры 63.Характеристики олигомерных форм урокиназы приведены в табл. 2.Т а б л и ц а 2 Активность исходной и олигомерных форм урокиназы определяют по усовершенствованному методу Аструпа на фибриновых пленках. Расчет активности проводят покалибровочной зависимости, полученной для стандартной урокиназы с5 активностью 500 ед. Полуга на ампулу.В качестве активных олигомерныхформ используют смесь димеров итрнмеров, отделяя высшие олигомеры,характеризующиеся пониженной биологической активностью.При лечении экспериментальнойгифемы терапевтический эффект приодно- или двукратном введении олигомерной активной формы урокиназыаналогичен терапевтическому эффектупри шестикратном введении мономер-.ной урокиназы в эквивалентных дозировках на одну инъекцию,20 Это.свидетельствует о существовании пролонгирования действия модифицированной олигомерной активной формы урокиназы.