Способ мечения радиоактивным предшественником дезоксирибонуклеиновой кислоты проростков кукурузы

(9 ц 6 01 й 33(6 ОМИТЕТ СС НИЙ И ОТНРЬ ГОСУДАРСТВЕННЫ ПО ДЕЛАМ ИЗОБ САЙКЕ И ЗОБРЕТЕНИ ОРСИОМЮ(71) Всесоюзный ордена Ленина и ордена Тдового Красного Знамени селекционно-генетический институт(56) 1. Махлаева Р, Ф., Тютерев С. Л,Изучение геномов пшениц и ее диких сородичей методом молекулярной гибридизации,ДНК-ДНК, Труды по прикладной ботанике,генетике и селекции. Т, 52, в. 1, 1973,с, 69-75.2, Р 1 апт апд Се 11 РЬуа 1 о 1, 18, НО 11,.173-180, 1977 (прототип).(54) (57) СПОСОБ МЕЧЕНИЯ РАДИОАКТИВНЫМПРЕДШЕСТВЕННИКОМ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИ., НООЙ КИСЛОТЫ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ,включающий проращивание зародышей со щитками в стерильных условиях на, минеральнойсреде с аденозином и радиоактивным тпмидином,отличающийся тем,что,сцелью повышения удельной радиоактивностидезоксирибонуклеиновой кислоты при нормальном росте растений и снижения затратрадиоактивного тимидина, перед отделениемзародышей с щитками семена предварительнозамачивают в 0,002%-ном растворе амнноптерина, высушивают и проращиваютчетверосуток на минеральной среде, в состав которойдополнительно вводят амнноптернн в концентрвонн О,ОО 2% н пврвнновктивнвов тнывдвн до Шконцентрации 0,004%, при эхом концентрация Сваеаденозина в среде составляет 0,004%.Изобретение относится к биохимии растеМечение дезоксирибонуклеиновой кислоты 1 ДНК) радиоактивным изатопом и применение ДНК с радиоактивным индикатором5 необходимо для Ныполнения цтирокого круга исследований в физиологии, биохимии и моле. кулярной биологии.Известны методы введения радиоактивной метки в ДНК 1 и ч 1 тго, например надирова ние, метилираванне, матричный ДНК.налиме.разный синтез 11. Эти методы обеспечивают высокую удельную рациоактивность препара.тов ДНК, но имеют свои отрицательные осо. бенности, заключаюцреся в изменении, подчас значительном, структуры, степени полимерности и нативнасти меченой ДНК, что не позволяет использовать ее в тех экспериментах, где требования к вышеперечисленным характеристикам должны быть соблюдены. Известен также способ мечения радиоак. зттвным предшественником дезоксирибонуклеиновой кислоты праростков растений, вклю. чающий. проращиванне зародышей со щитками в стерильных условиях на минеральной среде с адснозинам и радиоактивным тими- дином 2. Однако при проращивании не удается получить высокомеченые препараты ДНК высших растений, Это связано со значительным пулом цредшественникав синтеза ДНК в семенах, перераспределением их из запасающих органов в развивающийся зародыцт и интенсивным эндогенным синтезом нуклеотидов, Для получения и чйа более высокамечеиь 1 х препаратов ДНК высц 1 их растений необходимо повышать кон. центрацию радиоактивного предшественника в среде и/или использовать препратьт с высокой удельной радиоактивностью, что40 связано с увеличением затрат на радиоактив. ные вещества, повышением общей радиоак. тивностн на рабочем месте и усилением радиоактивного облучения всего растительного объекта.45Целью изобретения является повышение удельной радиоактивности дезоксирибонук, леиновой кислоты при нормальном росте растений и снижение затрат радиоактивного тимт 1 дица, 50Цель достигается тем, что перед отделением зародышей с;итками семена предварительно замачивают в 0,002%.ном растворе аминоптерина, высушивают и проращивают четверо суток на минеральной среде, в состав кота. 55 рой дополнительно вводят аминоптерин в концентрации 0,002%, и перадиоактивный тимицин до концентрации 0,004%, при этомконцентрация алеиозина в среде составляет 0,004%.Суть способа заключается в том, что осутцествляется большее включение радиаактивнога экзогенного предшественника в ДНК за счет блокировки энлогенного синтеза предшественника. Введение в минеральную среду для прорашивания растений аминоптерина в качестве ингибнтора подавляет син. тез в клетках тимидинмонофасфата, что создает тимидиновый "дефицит", Это позво. ляет добиться большего включения радио.активного экзогенного предшественника ДНК (тимндина) без увеличения концентрации последнего в среде,Проведено изучение включения н-тимицина в ДНК проростков кукурузы и что.Семена кукурузы замачивают в растворе аминоптерина 20 мкг/мл 6 - 8 ч, отделяют зародыши са щитком и высушивают под вентилятором.Зародыши са щитком стерилизуют и выращивают в асептических условиях в чашках Петри (или стаканах) при 26 - 28 С на среде, содержащей, вес.%:КС 1КМОзйаНтРОтСа(ИО)8280+М 930АденозинТимидин 0,0680,01350,01250,020,020,00950,0040,0041 Н-тимидин добавляется до концентрации 0,2 вс 1/мл;Н-тимиднн, В/О "Изотоп", 12,7 С/мм)0,002 Аминоптерин По окончании инкубацин срезают побеги и корешки, из которых ДНК выделяют стандартным методом. Количество экстрагиро. ванной ДНК и ее чистоту определяют спект. рофотометрически, Радноактивност 1 препарата ДНК измеряют на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Результаты выражают в значе. ниях удельной радиоактивности ДНК - импульсах/мин/мкг. Сравнивают радиоактивность ЛНК из про ростков, выращенных из семян, и зародышей с щитком на среде без ингибитора эндогенного синтеза предшественника ДНК (аминоптерина) и из прорасткав, выращенных из зародышей с щитком на среле с аминоптерином (предложенный способ). Исследования прове- лены во временной линамнке.3 938672 4Проращивание по предложенному способу сов/мин/мкг, проросгков из зароды пей с пе вызывает изменения характера динамики щитком, выращенных на среде без синтеза ДНК в растении. Максимальный уро аминоптерина6 600 имп/мин/мкт, дНК вень включения радиоактивного предшествен- проростков из семян 4 100 (4 суток проника наблюдается и четвертым суткам прора ращнвания) (" эффективность счета 6%). . щивания. Предложенный способ меченияпозволяет значительно увеличить включение В табл. 1 показано влияние срока прора- Н тиьшдина в ДНК. Удельная радиоактив- щивания растений на удельную радиоактивность ДНК проростков, выращенных заявляе- ность ДНК в проросгках кукурузы мым способом, составила 12 000 импуль (имп/мин/мкг). фТаб лица 1 Удельная радиоактивность ДНК в проросткахкукурузы (иван/мин/мкг 1 при различных сроках вырацщвания Время выращивания Удельная радиоактивность ДНК в проростках, выра. щенных на среде с амино. птерином Н-тимидин.э0,2 вС 1/мл 2400 11,300 8.200 300 300 Удельная радиоактивность ДНК в проростках, выращенных на среде без аминоптерина Н.тимидин 0,2 вС 1/мл 2200 5.900 5,600 200 200 Таблица 2 Время выращивания 1 2 4 7 сутки суток суток суток(заявляемый способ)5,605)59 3,44 5,74 На среде без аминоптерина(прототип) 4,75 3,45 3,68 3,30 Как видно из табл, 2, при заявляемомспособе мечения наблюдается более высокаяэффективность использования экэогенного радиоактивного предшественника. Она выряжается более высоким процентом включения радио.активной метки в кислотонерасчворпмуто гКак видно иэ табл. 1, при использовании одного и того же количества радиоактивного тимидина по заявленному способу мечения по-лучается ДНК с более высокой удельной радиоактивностью, причем эффект35 повышения удельной активности проявляется заметнее после вторых суток инкубацни и наиболее выражен на четвертые сутки, Для получения ДНК с удельной радиоактивностью 11300 нмп/мин, мкг, которая достига ется по заявленному методу к четвертым суткам выращивания, известным способом требуется либо вдвое увеличить концентрацию.радиоактивного предшественника, либо приме.нять в той же концентрации предшественникс соответственно увеличенной удельной актив.постыл, в общем требуется увеличить общуюрадиоактивность предшественника,Процент включешщ радиоактивного предшественника в кислотонерастворимую фракциюнроростков от общей радиоактивности, поглощенной проростками, представлен в табл. 2,938672 фракцию проростков, содержащую ЛНК, от тобщей радиоактивности, поглощенной пророст ками.Из табл, 1 видно также, что максимальная радиоактивность ДНК отмечается нри выращивании проростков в течение четырех суток,Ваюее составе среды из вес ороростков рзстенва Г 1 1 Г 11 1 Г45 5 о 9 т 5 экспериментах подбирался состав держащей основные ингредиенты . ерин.ингибитор эндогенного синтеза венника ДНК; тимидин и аденозин) соотношениях, при которых рост ов не отличался бы от контроля, 3 видно, что увеличиватьконцентраноптерина в среде более 0,002 вес.% У 2) нецелесообразно, так как Техред Ж.Кастелевич Коррек 3 имокосов Редактор О, Юркова Заказ 2906/6 Тираж 897 ПодпиВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж.35, Раущская наб., д. 4/5 е Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 В этих среды, со(аьзинопт предш ест таких Из табл,цию амипри этом сохраняется и высокая эффектив.ность включения в ДИК поглощенной пророст.ками радиоактивной метки (табл.2).Для уточнения состава ингредиентов среды3 проведены предварительные эксперименты, результаты которых приведены в табл. 3.минерзпзизз средз + змююптерии + добзвкв более высокие концентрации аминоптерина(вариант Ке 3) не вызывают заметного увеличения ингибирования роста. Кроме того, оптимальной средой, содержащей аминоптерин, Зч при выращивании накоторой рост проростковпрактически не отличается от контроля, яв. ляется среда варианта Ке 9, в которой концентрация аминоцтерина составляет 0,002 вес.%, тимидина - 0,004 вес.%, и аденоэина - 0,004 вес,%,