Способ определения осмотической резистентности лейкоцитов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскикСоцмалнстмческнкВеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(22) Заявлено 070580 (21) 2938624/30-15 1 з 1 М. Кп.з с присоединением заявки МЗ(23) Приоритет С 01 Н 33/96 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 28,0282, Бюллетень Мо 8 Дата опубликования описания 17.03.82 72 Авторыизобретения(71) Заявитель государственный им. Н.П.Огарева ниверсите М ск СОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКО РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВтентности лейкоцитов кческому фактору,Цель изобретения - пэффективности и точностния. ипоосмотибиологии в клиникоких исслеение делеяияейко аны ныхал В качестве ингибитораопьэуют контрикал илие 1000"6000 Ед. теолиза эилол в Изобретение относится ки может быть использованолабораторных гематологичесдованиях.Известен способ изучения осмотической резистентности лейкоцитов, заключающийся в инкубации изолирова ных лейкоцитов в гипоосмолярной среде, содержащей краситель, с последующим подсчетом неразрушенных клеток в счетных камерах 1.Недостатком указанного способа является качественный характер реакции, длительность анализа (свыш 3 ч), значительная трудоемкость (подсчет клеток осуществляется пяти кратно в течение 3 ч).Известен также способ количественной регистрации реакции аллергического лейкоцитолиэа, заключающий" ся в автоматической регистрации изменений суммарного электрического сопротивления взвеси иэолированлейкоцитов при инкубации их слергеном 2.Недостатком известного способа является применимость его,лишь для регистрации реакции специфического аллергического лейкоцитолиэа беэ учета уровня неспецифической реэисУказ ая цель достигаетстем, что в способе определеносмотической резистентности лцитов, включающем измерение суммарного электрического сопротивлениялейкоцитарной взвеси в инкубационнойсреде, в качестве инкубационнойсреды используют гипоосмолярнуюсмесь, состоящую из 50 мл 1,3 105 ф 10 " И буферного раствора с рН 6,68,0, лейкоцитарную. взвесь вносятв количестве 100, - 250 мкл, послечего полученную среду вносят в конт" 20 рольную и опытную кюветы кондукто-,метрической установки, затем в контрольную кювету добавляют 0,15.- 0,05 мл ингибитора протеолиэа и измеряют изменение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарнойвзвеси в опытной кювете по отношению к контрольной.(1) с зависимкл 45 Содержание лейко 5 цитов в 1 мкл зффициент 2,6 2000 50 1,7 00 500 00 На Фиг. 1 изображена осмотическая лейкограмма при граничных значениях ,параметров способа; на Фиг. 2 - ,то же, по средним значениям парамет;ров способа.П р и м е р 1. Приготовление 5 инкубационной смеси. В пробирку, содержащую 5,0 мл 1,2510 М трис" лимонного буфера, вносят 200 мкл лейковэвеси в аутоплазме. Полученную инкубационную смесь по 2,25 мл вно сят в контрольную и опытную кюветы кондуктометрической Густановки. Реакция в контрольной пробирке ингибируется добавлением 0,05 мл контри- кала. При 37 С реакция продолжается 15 45 мин (табл. 1).Обработка графичеСкой записи заключается в количественной оценке интенсивности осмотического лиэиса лейкоцитов по Формуле Д 1С 4, где И - отклонение пера самопишущего милливольтметра, мм- время реакции, мин;Ч - объем взвеси лей коцитов в аутоплазме, равный 200 мкл с 1 - коэффициент разведения лейко-;: взвеси, равный 26; С - содержание лейкоцитов в 1 мкл лейковэвеси; В" , показатель интенсивности гипоосмо лярного лейколизиса в условных единицах.Поскольку значения Ч и О являют" ся постоянными величинами, то выражение -М- представляют в виде козф фициента, значения которого изменяют"сся в зависимости от содержания лей. коцитов в 1 мкл лейковэвеси (С,), а выражение,(1) представляют в виде формулы 40 В = )с 4 (2)ВЗначения коэффициента К в мости от уровня лейкоцитов в 1 лейковзвеси (С) представлены в табл. 1.О скорости ливиса лейкоцитов в гипоосмолярно 9 среде, т.е, о характере их осмотической резистентности,0 судят также по осмотическим лейкограммам (фиг. 1 и 2), где по оси ординат откладывают процент разрушенных клеток, а по оси абсцисс . время изменения реакции в минутах Для этого определяют процент сдвига писчика за равные интервалы времейи(О -9, 9 -18, 18" -27, 27 -36 36 -45 , принимая максимальное откло" нение писчика Вд за 100 .П р и м е р 2. Концентрацию буФер. ного раствора для работы с серийной кондуктометрической установкой, на" пример ффермент"1, определяют требованием к соблюдению минимально" Го фона, т. е. обеспечением минй мального вклада концентрации носителей электрических зарядов буферного раствора в суммарную электропроводность инкубационной смеси в ходе реакции субстрат - Фермент. Оптимальные значения концентраций буФерных растворов для указанных целей находятся в пределах 10 - 5,10 М.Концентрация субстрата при кондук-тометрических исследованиях лежиТ в . диапазоне 10 - 10 М, Опытным путем нами установлено, что кинетическая кривая реакции гипоосмолярного лей-. колизиса сохраняет линейный характер при объеме лейкоцитарной взвеси от60 мкл до 300 мкл, однако при объеме лейковзвеси 60 - 100 мкл угол наклона кривой слишком мал.Наилучшие результаты реакции гипоосмолярного лейколизиса достигают при объеме лейковзвеси 150 250 мкл (табл. 2).Объем инкубационной смеси в измерительных кюветах (2,25 мл) кондуктометрической установки, напримерфффермеитф, опредЕлен емкостью ее кювет (2,5 мл)Ингибитор протеолиза в контрольной кювете (контрикал или тразилол) ,используют в концентрации 1000 6000 Ед в объеме 0,05 - 0,15 мл.Пример определения осмотической резистентности лейкоцитов при гранич"ных значениях параметров приведен,) ,в т.абл., 2.Уровень электропроводности в зна- . чительной мере зависит от температуры, при которой протекает исследуемая реакция. Поэтому все кондук-, ;тометрические измерения проводят с ф ,обязательным и строгим соблюдением постоянства значений температуры в измерительных кюветах.Предлагаемый способ в значительной мере автоматизирован, требует в 4 раза меньших затрат времени, по сравнению с известным качественным способом обладает более высокой точностью (ошибка кондуктометрического способа не превышает 4 , тогда как ошибка метода при подсчете лейкоцитов в камере составляет 7 ) .Таблица 1.7000 О,69 7500 0,33 0,65 8 ООО О,зг 0,61 8500 0,31 058 9000 0,30 0,29 0,54 9500 0,52 0,27 10000 10500 11000 11500 12000 12500 0,500,47 0,45 0,26 0,20 0,43 30000 0,17 0,42 Таблица 2 Показатели осмотического лейколизиса Граничныезначенияпараметров 36 45 Ьбс.В % абс.Ъ %абс.В Ъ абс.Ф %. абс.З Ф Концентрация буферного раствора 1 М 1,3105 10 ф 21 47,0 29. 235 33 176 36 11,8 38 0 18 437 25 25,0 2918,7 32 12,5 34 0 Объем лейковзвеси; мкл150250 11 . 37,5 17 31,2 22 18,7 2512,5 27 0 18 38,9 25 27,8 30 16,7 33 16,7 36 0 Концентрацияантиферментнйхпрепаратов-ингибиторов протеолиза, Ед1000 (контрикал)13, 6000 18 35,7 18 44,4 26 286 22 21,4 25 14,3 27 0 27,8 31 16,7 34 11,1 36 0 формула изобретения чаюций измерение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной1, Способ определения осмотичес- взвеси в инкубационной среде, о т кой резистентностн лейкоцитов, вклв я и ч а в а 1 и й с я тем, что, с909635 4 б м Составитель А.МакаровКрупенина Техред М. Рейвес орректор А.ференц е т Тираж . 883 осударственного лам изобретений осква, Ж, Ра Заказ 2418ВНИИПИпо д113035,дписно.Покомитета СССРи открытийушская наб д. Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,.4 целью повышения эффективности и точности определения, в качестве инкубационной среды используют гипоосмолярную смесь, состоящую иэ 5,0 мл1,3 10 - 5 1(Г М буферного раствора с рН 6,0 - 8,0, лейкоцитарнуювзвесь вносят в количестве 100250 мкл, после чего полученную средувносят в равных объемах в контрольную и опытную кюветы кондуктометрической установки, затем в контрольную кювету добавляют 0,15 - 0,05 млингибитора протеолиэа и измеряют изменение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной взвеси в опытной кювете по отношению к контрольной.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ н й с я тем, что в качестве ингибитора протеолиза используют контрикал или траэилол в дозе 1000 6000 Ед.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Сененко А.Н. Лабораторное дело, 1 962, 9 7.2. Демьяненко С.М. Проблемы туберкулеэаф, 1979, 9 8.