Способ получения рибофлавина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 2 Р 25 00ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ЗОБРЕТЕНИЯ ЕЛЬСТВУ Ждановова сследоваки и селекганиэмов(56) 1. Авторское свидетельство СССРУ 389132, кл. С 12 Р 5/04, 1969.2. Патент США У 3900368,кл. 195-96, опублик. 1976.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОфЛАВИ"НА путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Вас 111 из зиЬ 1111 з в условиях аэрации на.питательной среде,ОПИСАНИЕ АВГОРСКОМУ СВ(71) Всесоюзный научно-ительский институт генетиции промышленных микроор,ЛО,908092 содержащей источник углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода рибофлавина, в качестве продуцирующих рибофлавин микроорганизмов из вида Вас 11 из,зиЬйд 1 ь.з используют штамм Вас 111 оз зоЬйд 11 з ВНИИгенетикаили ВНИИгенетикаа.2, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мепассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный.концентрат или его гидролизат или автолизат,или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.908Изобретение относится к микробио логической промьппленности, а именно к способу получения рибофлавина(Вг) .Витамин Вг широко используется в5 сельском хозяйстве, в основном в качестве кормовых добавок сельскохозяйственным животным, а кристаллический рибофлавин применяется в пищевой и Фармацевтической промьппленности. Рибофлавин получают химическим способом, а также путем микробиологического синтеза.Известен способ микробиологического производства рибофлавина путем использования культуры гриба ЕгешоЬесцш аязу на соевой Ферментационной среде, содержащей гидрол и кукурузный экстракт и . За 96 ч процесса ферментации накапливается до 2000 мг/л В . К недостаткам такого способа следует отнести длительный период роста культуры, вследствие чего увеличивается продолжительностьФерментации,иповьппенную чувствительность к загрязнению посторонней микрофлорой.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения рибофлавиЗО на-витамина В путем культивированиягего продуцентов-микроорганизмов видаВас 11 ця яцЪсд 1 хя на питательной среде, содержащей 87 глюкозы в качестве источника углерода, минеральные соли и источники ростовых вещестпз дрожжевой экстракт, пептон, глутами-новую кислоту, препараты РНК, пурины и аналоги пуринов 2 3. За 44 ч процесса ферментации накапливалось до 560 мг/л рибофлавина,Недостатками способа является сравнительно низкий уровень активности, достигаемый культурой Вас 11 ця ,яцЬг.дЫя и необходимость в дорогостоящих и дефицитных компонентах ферментационной и ростовой сред.Целью изобретения является повышение выхоДа рибофлавина.Поставленная цель достигается тем, что в способе получения рибофлавина, предусматривающем глубинное культивирование продуцирующих его .микроорганизмов вида Васг 11 ця яцЪ- .йь 1 дя в условиях аэрации на питатель- ной среде, содержащей источник угле рода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ, в качестве продуци 092 2рующих рибофлавин микроорганизмов.из вида Вас 11 ця яцЪ 11 я используют,штамм ВасЫ 11 ця яцЬг 1 я ВНИИгенетикаили ВНИИгенетикаа.При этом культивирование ведутна питательной среде, содержащей вкачестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентратили его гидролизат или автолизат,или пищевые дрожжи, или дрожжевойэкстракт,Используемые штаммы-сверхсинтетики сконструированы генетическими методами из независимо полученных мутаций, каждая из которыхприводит к сверхсинтезу витамина:гоя - гЬс - АСН (устойчивость кирозеофлавину гоя, мутация в генерегуляторе гЬя, устойчивость к8-азагуанину АСН). Затем проводилась мутагенная обработка нитрозогуанидином, нитрозометилмочеви"ной, облучение ультрафиолетом иселекция активных вариантов наферментационной средеШтамм ВНИИгенетика-прототроф,штамм ВНИИгенетикаа - ауксотрофс неидентифицированной ростовойпотребностью. Оба штамма олигоспорогенные, на всех средах количество спор по сравнению с исходнымштаммом снижено на 3-4 порядка.Способ осуществляют следующимобразом.Культуру ВНИИгенетикаилиВНИИгенетикаа выращивают на агаризованной среде Хоттингера или мясо-пептонном агаре (МПА) в течение1-2 суток при температуре 28-37 С.Затем суспензию клеток передают вколбы с посевной средой, содержащеймелассу, БВК и минеральные соли,либо в картофельную посевную среду,либо МПБ. Посевной материал выращивают в течение 17-24 ч на качалке200 об/мин, Затем посевной материалпередают в количестве 5-107 в основную ферментационную среду. Процессферментации осуществляют в колбахЭрленмейера на качалке, либо вферментере при интенсивном перемешивании и аэрации в течение 46-50 чнри температуре 37 С, рН 6,5-7,59080 3зу, сахар-сырец, мелассу, крахмал источники минерального азота, например соли аммония, мочевнны нитраты; соли фосфора, например, фосфата калия, аммония и другие соли; соли Мп(МпС 1 , Мп 804), а также источ 5 ники ростовых факторов, например, биомассу кормового дрожжевого белка (БВК), гидролизаты и автолизаты БВК, пищевые дрожжи, дрожжевой экстракт, кукурузную и соевую муку, кукурузный экстракт., гидролизат казеина, пептон. Через 46-50 часов ферментации в культуральной жидкости накапливается 700-1000 мг/л рибофлавина.П р и м е р 1. Односуточную культуру Вас 11 цв вцЬ 1 дв ВНИИгенетика, выращенную на косяках МПА, пересеивают на жидкую посевную среду, содержащую 6% мелассы, 1% БВК и, 20 минеральные соли, Посевная среда готовится разведением пополам стерильной водой ферментационной среды, состав которой приведен ниже. Выращивание посевного материала проводят в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл (объемсреды 25-100 мп), на качалке 200 об/мин при 37 С в течение 17 часов и передают в количестве 10% в ферментационную среду следующего состава, %: Меласса 12БВК 2(НН,) БО, 0,2К,НРО 1,40,6 35МяБО 0,01НаС Н О, (цитрат Иа) 0,1 РН7,0-7,2.Ферментацию осуществляют в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл 40 (объем среды 25 мл) на качалке 20 об/мин при 37 С. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина.П р и м е р 2. Аналогичен приме, ру 1, только используют штамм Васд 11 цв вцЬед 1 ва.П р и м е р 3. В качестве продуцента также используют штаммы ВНИИгенетика/304. Ферментационная 50 среда и условия ферментации, как указано в примере 1. Отличием является состав посевной среды, которая готовится следующим образом. Картофель очищают от кожуры, режут на 55 куски и заливают небольшим количест- вом воды, после чего стерилизуют при 0,8-1 атм. Посевную среду за 92 4севают с косяков МПА, культура растет в колбах на 750 мл (объем среды 50-100 мл) на качалке при 37 С в течение 24 ч, ферментацион-о ную среду засевают 10% посевного ,материала, ферментацию проводят, как в примере 1.Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавинаП р и м е р 4. Так же как в примере 3, только используют штамм Вас 11 цв вцЬд 1 два.П р и м е р 5. Культура, посевная среда, условия ферментации, как в примерах 1,2 и 3. Отличием является состав ферментационной среды,%:Сахароза (илисахар-сырец) 12-14БВК 3-4Минеральные соли, как в примере 1.Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700- 1000 мг/л рибофлавина.П р и м е р 6. Односуточную культуру штамма ВНИИгенетикас косяков МПА переносят в посевную среду МПБ, на которой 8-10 ч на качалке при 37 ОС готовится. посевной материал. В количестве 10% посевной материал переносится в ферментационную среду, имеющую состав,%:Глюкоза 8Дрожжевойэкстракт 0,5Гидролиэатказеина или пептон 0,02Минеральныесоли как в примере 1.рН 7, 1-7,2. Ферментация длится 44-50 ч при 37 С вколбах на качалке 200 об/мин. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина.Максимальный выход рибофлавина в предлагаемом способе составляет 1000 мг/л за 48 ч роста культуры на синтетических или крмплексных средах, что на 40% превосходит активность штаммов-прбдуцентов в прототипе. Кроме того, в отличие от указанного прототипа, используют более простые среды, не содержащие дорогостоящих компонентов.Получение рибофлавина предлагаемым способом обладает рядом преимуществ по сравнению с пействую908092 Культурально-морфологическая характеристика штаммов-продуцентов рибофлавина Вас. зоЬйх 1 з ВНИИгенетикаи ВНИИгенетикаа. Штамм ВНИИгенетикаа Штамм ВНИИгенетикаМорфология под микроскопомМорфология на разных средахМясо-пептонный агар (МПА) Спорообразующая граммположительйая палочкадлиной 2-3 р,На 1-2 сутки роста при 28-37 С образует колонии с неровным краем, звездчатые,диаметром 3-4 мм, поверхность гладкая, блестящая,цвет желтоватый. Рост по уколу умеренный,в основном на поверхности среды; Мясо-пептонный бульон (МПБ) Рост без качания на поверхности бульона ввиде пленки.На 2 сутки роста образует колонии диаметром 2-3 мм, ярко-желтого цвета, флоурисцируют в УФ-лучах желтым цветом, колониикруглые с гладким краем, блестящие Минимальны средаСпицайзена с глюкозой Не растет на минимальной среде Растет при 20-42 С, оптимум 37 С рН 5,0-9,0,оптимум 7, 0"8,0.Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, сахарозу, крахмал.Спирты: утилизируют этанол, сорбитолИсточники азота: хорошо усваивает аммоний,мочевину, нитраты.Желатину разжижает. Физиологические свойства Техред С.Мигунова Корректор А, Ильин Редактор С. Титова Заказ 9246/4 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4 щими в настоящее время произволством рибофлавина с помощью аскомицета ЕгешойЬеаца цзЬЪуад (базовьи способом). Помимо уже упоминавшейся меньшей требовательностик составу питательных сред в предлагаемом способе почти вдвое сокращается время ферментации (48 ч вместо 72-9 б ч), а также уменьшается возможность загрязнения культуры посторонней микрофлорой.По сравнению с прототипом пред лагаемый способ характеризуетсяболее высоким уровнем выхода продукта и возможностью использовать простые и доступные по составу среды.