Способ диагностики лимфоцитарного хориоменингита

Союз Советских Социалистических Республик(51)м. Кл. с присоединением заявки Ио А 61 В 10/00 Государственный конитет СССР по делан изобретений и открытийДата опубликования описания 30,1080(72) Авторы изобретения Л.Е, Подоплекина, Т,А. Менявцева, Ю,В. Фед и О,А, Васильева с;. Д с 3 цЯ-,., Д ъ 7 Томский ордена Трудового Красного Знамени научно" исследовательский институт вакцин и сывороток(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛИМФОЦИТАРНОГО ХОРИОМЕНИНГИТА Изобретение относится к областимедицины и может быть использованодля ранней аллергодиагностики инфекционного заболевания лимфоцитариогохориоменингита,Известен способ диагностики лимфоцитарногб хориоменингита путем постановки реакции взаимодействия антигеьа и антитела 11 .1 ООднако известный способ не обеспечивает ранней диагностики заболевания,Целью изобретения является ранняядиагностика заболевания,Эта цель достигается темчто вкачестве антигена используют аллергек, полученный из мозга зараженныхмышей-сосунков, исследуют кровь спомощью аллергических тестов 1 пч 1 сго и по повышенной чувствительности организма к вирусу лимфоцитарного хориоменикгита диагностируют наличие заболевания,Кроме того, в качестве аллергических тестов используют показатель повреждения нейтрофилов крови, коэффициент ливиса лейкоцитов и непрямую дегрануляцию тучных клеток, 30. Способ осуществляется следующимобразом,Приготовление аллергенов,Дляпостановки указанных реакций- используют 2 вида аллергенов. Первый готовят из мозга новорожденных мышей,инФицированных вирусом лимфоцитарного хориомеиингита ЛХМ, путем боратно-солевой экстракции актигека вируса, который затем освобождают отбалластных белков фреоном 113, инактивируют и лиофилиэируют. без каполнителя, Для этого 2 - 3 дневных мышей-сосунков, вскармпиваемых матками, заражают интрацеребрально по0,02 мм 1-кой вируссодержащей суспензией мозга мыпей и несколькоштук (5 - 10) взрослых белых мьхпей(при лимфоцитарном хориоменингитеноворожденные мыши не болеют, новирус хорошо размножается в ихмозге, поэтому параллелько для контроля заражают взрослых мьхаей, кото"рые болеют с явными клиническимипроявлениями). На б - 7 день послезаражения при появлении признаковзаболевания у взрослых мышей всюпартию новорожденных мыаей забивают изабирают мозг, Из последнего готовят20-кую суспензню (1 мп на 1 мозг)бО на боратно-солевом растворе ИаС 6 срН 9,0. К приготовленной суспенэиидобавляют фреон 113 в объеме 1;1,смесь тщательно переьешивают и помещают в бытовой холодильник на 4суток постоянно взбалтывая, Далеепроизводят центрифугирование при6000 об/мин в течение 20 мин притемпературе от 0 до +4 . После центрифугирования антиген для полнойинактивации вир)са выдерживают вхолодильнике при 4 С в течение двухнедель, затем подвергают лиофилизациина вакуум-сушильной установке в течение 36 ч, Ампулы с высушенным препаратом гермэтизируют под вакуумом,Характеристикой, аллергена служатего антигенная активность в РСК и со"держание в нем белка, Антигеннаяактивность этого аллергена э РСК1:128, количество белка - 650 мг ,Контрольный аллерген готовят тем жеспособом иэ Йозга незараженных вирусом ЛХМ новорожденных животных,содержание белка в нем составляет728 мг ,фКультурный 1 аллерген представляет собой вируссодержащую жидкостьклеток эмбриона человека (КЭЧ) науровне 2-го пассажа вируса ЛХМ вэтой клеточной культуре. Клеткидо инфицирования (2-4 суток) выращивают в 100 мл (матрасах) насреде 199 с 10-ной бычьей сывороткой до образования монослоя, затемзаражают вирусом в виде 10-нойсуспенэии инфицированного мозга мы"шей В ДОзе 10 - 10 ЛДЭО, ПОСЛЯ40 минутной адсорбции вируса при22 С клетки трехкратно отмывают раствором Хэнкса и заливают средой 199без сыворотки, Через 3 суток инкубации при 37 ОС матрасы с инфицированными клетками и жидкостью эамораживают, затем оттаивают, ценгрифугируют при 3000 об/мин 20 мин ииспользуют для 1-го пассажа. В качестве ачлергена применяют 2-й пассажвируса на указанной клеточной культуре.Для этого 3-4 дневный клеточныймонослой, выращенный в матрасах100 мл, заражают вирусом 1-го пассажа на данной ткани. Ростовую среду199 с 10-ной бычьей сывороткисливают и заменяют средой 199 беэсыворотки в количестве 12 мл ссодержанием вируса 1000 ЛД д, Матрасыс инфицированными клетками инкубируют в термостате в течение 3 сутокпри температуре 37 С, после чего ихпомещают в замораживающий холодильник, затем оттаивают и используютв качестве аллергена,Для изготовления контрольногокультурального аллергена проделывают те же манипуляции, только припервом этапе в клетки вносят 10-нуюмозговую суспензию нормальных 5 19 15 26 25 ЗО 35 4 О 45(неинфицированны: ьнру ом ЛХМ) мы-.шей,Активность специфического (опытного) аллергена в РСК составляет1:16 - 1;32, количество белка до200 мг , в контрольном аллергенебелка содержится 134 мг ,Все контрольные аллергены проверяют в РСК с иммунной ЛХМ сывороткой,реакция во всех случаях должна бытьотрицательной,Для каждого пробирочного тестаподбирают свою дозу опытного и состветствующего контрольного аллергена.Так, для НДТК аллерген берут в цельном виде, для ППН и КЛЛ - в разведении 1;4 - 1;8,Для определения коэффициента лизиса лейкоцитов в опытную пробиркустерильной микропипеткой вносят0,025 мл рабочего раствора опытногоаллергена, в контрольную - 0,025 млрабочего раствора контрольногоаллергена на дистиллированной воде,Если аллергены жидкие, то для приготовления рабочего раствора соединяют 1 часть 50-ного раствора цитрата натрия с 8 частями аллергена,Сухие аллергены для приготовления .рабочего раствора растворяют в 5 ном растворе цитрата натрия, В обепробирки в околодонную часть вносятпо 0,1 мл крови. Для полученияантикоагулирующего эффекта содержимое пробирок слегка встряхивают.Пробирки помещают в термостат при37 бС . Через 2 ч содержимое пробироквчоэь встряхивают в целях равномерного распределения лейкоцитовво всем объеме смеси,Из каждой пробирки содержимоенабирают э меланжер, для белойкрови до метки 0,5 и до метки 11осторожно насасывают 5-ный растворуксусной кислоты. Меланжеры тщательно встряхивают, первые три капли выпускают на вату, затем заполняют камеру Горяева Под микроскопомс увеличением 8 х 10 считают лейкоциты в 100 больших квадратах, РЯэультаты обрабатывают по формуле: где КЛЛ - индекс коэффициента лизиса лейкоцитов;Нц - число лейкоцитов, насчитанное в 100 большихквадратах опытного препарата;й - число лейкоцитов, насчитанное в 100 большихквадратах контрольногопрепарата,Результат считают положительным при значении КЛЯ 0,10 и более.Для определения показателя повреждения нейтрофилов из содержимого пробирок сразу после взятия из25 О-кППН=100где ППН - го каз атель повреждениянейтрофилов;О - число поврежденных нейтрофилов в опыте;К - число поврежденных нейтрофилов в контроле;100 - количество просмотренныхв мазке клеток,Результат считают положительнымлри значении ППН больше 0,10,для постановки непрямой реакциидегрануляции тучных клеток кровьнабирают в сухую пробирку в количестве 1,0 мл, помещают в бытовойхолодильник, через 18 - 20 ч отсасывают сыворотку для реакции. Тучные клетки получают из перитонеального эксудата интактной крысй. Дляэтого крысе под глубоким эфирнымнаркозом вводят внутрибрюшинно5 - 8 мп подогретого до 37 С раствора рроде без глюкозы, После 1,5минутного легкого массажа брюшкаделают послойный разрез длиной 15 ммчерез все слои передней брюшнойстенки, Крысу быстро поворачиваютбрюшком вниз и собирают стекающийиз разреза по кишечным петлям эксудат с раствором Тироде.Взвеськлеток цинтрифугируют 2 мин при1 тыс, об/мин, 4/5 объема декантатаудаляют,. осадок ресусгендируют в 35 них крови меланжером готовят мазки средней толщины, Для этого используют химически чистые, обеэжиренные предметные стекла, Подсушенные на воздухе мазки маркируют и фиксируют 40 мин в спиртовом растворе нитрата меди и нитрата кальция с добавлением к нему непосредственно перед фиксацией формалина (на 100 мл 96 этилового спирта берут 1,8 г Сц (ИО), 0,9 г Са (ИО) и 10 мл 40-ного формалина)После фиксации мазки отмывают от формалина в трех порциях 96 оспирта (по 10 мин в каждой) и красят на выявление гликогена по методу Шабадаша: 40 мин выдерживают в растворе периодата при комнатной температуре, промывают 2 мин в дистиллированной воде, погружают на 30 - 40 мин в реактив Шиффа, обрабатывают в 2 порциях (по 3 мин в каждой) сернистой воды, промывают 30 мин в дистиллированной воде, ядра клеток докрашивают 5 - 8 мин ( в зависимости от качества красителя) . 0,1-ным раствором Аэура П, Мазки просматривают под микроскопом с иммерсионной системой, увеличение 90 х 10, В каждом препарате исследуют 100 нейтрофилов и определяют количество поврежденных, т.е, с проявлением амебоидной активности, Расчет результатов; оставшемся объеме надосадочнойжидкости, На предметное стекло, заранее окрашенное 0,3-ным спиртовым раствором нейтрального красного, наносят по капле исследуемойсыворотки, аллергена и взвеси туч-.ных клеток, тьзтельно смешиваютстеклянной палочкой и закрываютобезжиренным покровным стеклом, На отдельных стеклах проверяют пригодность (отсутствие спонтанной дегрануляции), токсичностьыворотки (,тучные клетки + сыворотка), аллергена (тучные клетки +(тучные клетки + сыворотка + контрольный аллерген), Все препаратыпомещают во влажные камеры и термостатируют 10 мин при 37 С, Препаратыпросматривают при увеличении 40 х 10,Определяют процент разрушенныхтучных клеток, Результат считаютположительным при разрушении более10 тучных клеток в опытном препарате при отрицательном контроле(меньше 10 разрушенных тучных клеток и 100 просмотренных),Опыты, проведенные на 10 группах экспериментальных животных (236 морских свинок) позволяют сделать вывод, что аллергическими методами 1 п ч 11 го возможно выявить сенсибилиэацию инфицированного организма вирусом ЛХМ, начиная С 3 дня инфекции, в то время, как внутрикожные аллергические пробы были положительными только с 14 дня заболевания. С этого же срока стала возможна и серодиагностика,Предлагаемый способ обеспечивает раннюю диагностику лимфицитарного хориоменингита, Любой из трех предлагаемых тестов обеспечивает раннее выявление заболевания, Все реакции просты, требуют минимального количества крови для исследования, воспроизводимы в практической лаборатории при наличии коммерческих аллергенов,Формула изобретения1, Способ диагностики лимфоцитарного хориоменингита путем постановки реакции взаимодействия антигена и антитела, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ранней диагностики заболевания, в качестве антигена используют аллерген, полученный из мозга зараженных ььзаей-сосунков, исследуют кровь с помощью аллергических тестов 1 п ч 11 го и по повышенной чувствительности организма к вирусу лимфоцитарного хориоменингита диагностируют наличие заболевания,2, Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве аллер774544 Составитель С. МалютинаРедактор Г. Прусова Техред З.Костелевич Корректор И. Демчик Заказ 7579/3 Тираж 673 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 филиал ППП Патентф, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 гических тестов используют показательповреждения нейтрофилов крови, козФФициент лизиса лейкоцитов и непрямую дегрануляцию тучных клеток. Источники инФормации,принятые во внимание при зкспертизЪ 1. Леви М,И, ЛимФоцитарный,хориоменингит, М., Медицина, 19 б 4,с, 124-125 (прототип).