Способ получения иммобилизованных нуклеофильных соединений

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 54 9) 08 Р 220/56, С 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АТЕНТУ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯВАННЫХ НУКЛЕОФИЛЬННИЙ(57) Изобретение относитсябилизации биологически актний, содержащих нуклеофиу-аминомасляной кислоты,мина бычьей сыворотки, глюкатал азы. Изобретение позестабильность полученных и ИММОБИЛИЗОЫХ СОЕДИНЕ- к способу иммоивных соединельные группы - глюкозы, альбукозооксидазы и оляет повысить родуктов за счет особу иммо- ыхсоединеые группы, ота, глюко- юкозооксишение ста я акрилекс й,й-метиют в 1200 мл фера (рН 8),-м(56) Авторское свидетельство СССРй. 530886, кл. С 12 й 11/08, 1975. Изобретение относится к сп билизации биологически активн ний, содержащих нуклеофильн таких как у-аминомасляная кисл за, альбумин бычьей сыворотки, гл даза и каталаза. Цель изобретения - повы бильности целевых продуктов. П р и м е р 1, 30 г ксерогел Р(сополимер акриламида и лен-бис-акриламида) суспендиру 0,1 М фосфатного калиевого бутого, что активизируют сополимер акриламида с й,й-метиленбисакриламидом путем добавления к суспензии сополимера в фосфатном буфере с рН 8 раствора п-бензохинона в водном диоксане при концентрации и-бензохинона в реакционной смеси 50 ммоль/л и реакционную смесь выдерживают при 50 С в течение 24 ч. Полученный гель промывают и подвергают взаимодействию с нуклеофильным соединением - у-аминомасляной кислотой, глюкозой, альбумином бычьей сыворотки, глюкозооксидазой или каталазой, Взаимодействие проводят путем добавления к гелю активированного сополимера раствора нуклеофильного соединения в буферной смеси с рН 3-9 и концентрацией у-аминомасляной кислоты и глюкозы 0,01 моль/л, а остальных соединений - 20 мг/мл. Смесьвыдерживают при 4 С в течение 24 ч при конечной концентрации у-аминомасляной кислоты и глюкозы 2,5 ммоль/л, а остальных нуклеофильных соединений - 5 мг/мл. 1 табл. после чего к полученной суспензии добавляют 0,25 моль и-бензохинона в 20-ном растворе диоксана(300 мл) и выдерживают ее.в течение 24 ч при 50 С. Концентрация п-бензохинона в смеси равна 50 ммоль/л. Набухший гель отделяют и последовательно промывают 3 л 20-ного раствора диоксана и 10 л дистиллированной воды. Отмытый гель лиофилизируют. В результате получают 24,3 г активированного носителя.П р и м е р 2, 0 1 г ксерогеля акрилекс Р(сополимер акиламида и й,й ети 1690544лен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл0,1 М буфера (рН 8), после чего к полученнойсуспенэии добавляют раствор 0,25 моль ибензохинона в 20 ф-ном растворе диоксана(1,0 мл) (концентрация и-бензохинона 50ммоль/л) и выдерживают ее в течение 24 чпри 50 С. Набухший гель отделяют и последовательно промывают 70 мл 20-ного раствора диоксана в 70 мп дистиллированнойводы,Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют кнему 2,0 мл 0,01-малярного раствора у-аминомасляной кислоты. Для растворения уаминомасляной кислдты используют0,1-молярный раствор калийнатрийфосфатного буфера (рН 7,5). Суспензию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, гель отделяют,а несвязанную у-аминомасляную кислотуудаляют путем промывки 0,1-молярным раствором натрийацетатного буфера (рН 5,0),содержащего 1,0 моль хлористого натрия и0,1-молярным раствором бикарбоната натрия (рН 8.5), Количество связанной уаминомасляной кислоты составляет 4,0 мкмоль,что соответствует 20 от всего ее количества в реакционной смеси.П р и м е р 3, 0,1 г ксерогеля акрилексР(сополимер акриламида и й,й -метилен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0),После добавки к суспензии раствора 0,25моль и-бензохинона в 200 ь-ном растворедиоксана (1,0 мл) ее оставляют стоять в течение 24 ч при 50"С, Затем набухший гельотделяют и последовательно промывают70 мл 200 -ного раствора диоксана и 70 млдистиллированной воды.Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют кнему 2,0 мл раствора альбумина бычьей сыворотки (20 мг/мл). Для растворения альбумина бычьей сыворотки используют0,1-моля рный натрийформиатный буферный раствор (рН 3,0). Суспенэию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, после чего гельотделяют и удаляют несвязанный альбуминсыворотки путем последовательной промывки 0,1-молярным раствором натрийацетатного буфера (рН 5,0), содержащего, 1,0 моль хлористого натрия и 0,1-молярнымраствором бикарбоната натрия (рН 8,5). Количество связанного альбумина бычьей сыворотки составляют 10 мг. Выход 25 врасчете на добавляемый к реакционнойсмеси альбумин сыворотки,П р и м е р 4, 0,1 г ксерогеля акрилексР(сополимер акриламида и й,й-метилен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего добавляют к полученной суспенэии раствор 0,25 моль и-бензохинона в 20 - ном растворе диоксана (1,0 мл) и составляют ее состоять в течение 24 ч при 50 С, Затем набухший гель отделяют и последовательно промывают 70 мл 20-ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды,Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему 2,0 мл раствора альбумина бычьей сыворотки (20 мг/мл), Для растворения альбумина бычьей сыворотки используют 0,1-малярный калийнатрийфосфатн ый буфер (р Н 6,0), Суспензию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, после чего гель отделяют, а несвязанный альбумин сыворотки удаляют путем последовательной промывки 0,1-молярным натрийацетатным буфером (рН 5,0), содержащим 1,0 моль хлористого натрия, и 0,1- молярным раствором бикарбоната натрия (рН 8,5). Количество связанного альбумина сыворотки составляет 4,5 мг, что соответствует 11,250 от всего его количества в реакционной смеси.П р и м е р 5. 0,1 г ксерогеля акрилекс Р(сополимер акриламида и М,й-метилен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл 0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего к полученной суспензии добавляют раствор 0,25 моль и-бенэохинона в 200 - ном растворе диоксана (1,0 мл) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50 С, Набухший гель отделяют и последовательно промывают 70 мл 20%-ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды.Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему 2,0 мл раствора альбумина бычьей сыворотки (20 мг/мл). Для растворения альбумина бычьей сыворотки используют 0,1-молярный буферный раствор карбоната и бикарбоната натрия (рН 9,0), Суспенэию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, после чего гель отделяют и удаляют несвязанный альбумин сыворотки путем последовательной промывки его 0,1-молярным натрийацетатным буфером, содержащим 1,0 моль хлористого натрия (рН 5,0), и 0,1-молярным раствором бикарбоната натрия, Количество связанного альбумина бычьей сыворотки составляет 5,0 мг, что соответствует 12,57 ь от общего его количества в реакционной смеси.П р и м е р 6, 0,1 г ксерогеля акрилекс Р(сополимер акриламида и й,й-метилен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл 0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего к полученной Суспензии добавляют раствор 0,25 моль и-бенэохинона в 207(,1690544,реакционной смеси 50 55 ном растворе диоксана (1 мл) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50 С. Набухшийгель отделяют и промывают последовательно 70 мл 20-ного раствора диоксана.и 70мл дистиллированной воды.Активированный гель отфильтровывают на вакуумной фильтре и добавляют кнему 2,0 мл раствора глюкозооксидазы(20 мг/мл). Для растворения глюкозооксидаэы используют 0,1-молярный калийнатрийфосфатный буфер (рН 7,5). Суспензиювыдерживают в течение 24 ч при 4 С, гельотделяют, а несвязанный блок удаляют путем последовательной промывки 0,1-молярным натрийацетатным буфером, содержащим 1,0 моль хлористого натрия (рН 5,0),и 0,1-молярным раствором бикарбоната натрия (рН 8,5).Количество связанного с гелем белкасоставляет 4,5 мг. Активность полученногопродукта равна 7,2 ед,/г ксерогеля. Однаединица активности соответствует тому количеству фермента, которое обеспечиваеткаталитическое окисление 1,0 мкмоль В-Оглюкозы в минуту при рН 7,0 и температуре25 С. Удельная активность связанного фермента составляет 8% от удельной активности растворенного фермента.П р и м е р 7. 0,1 г ксерогеля акрилексР(сополимер акриламида и М,й-мети-лен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл0,1-малярного фосфатного буфера (рН 8,0),после чего к полученной суспензии добавляют раствор 0,25 моль п-бензохинона в 20 ном растворе диоксана (1,0 мл) ивыдерживают ее в течение 24 ч при 50 С.Набухший гель отделяют и промывают последовательно 70 мл 20 о -ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды.Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют кнему 2,0 мл раствора каталазы (20 мг/мл).Для растворения каталаэы используют 0,1 малярный раствор калийнатрийфосфатногобуфера (рН 7,5), Суспенэию выдерживают втечение 24 ч при 4 С, гель отделяют и удаляют несвязанный белок путем последовательной промывки 0,1-молярным натрийацетатным буфером, содержащим 1,0моль хлористого натрия (рН 5,0) и 0,1-молярным раствором бикарбоната натрия (рН8,5),Количество связанного белка составляет 5,3 мг, активность полученного продуктаравна 2100 ед./г ксерогеля. Одна единицаактивности соответствует тому количествуфермента, которое катализирует разложение 1 мкмоль перекиси водорода в минутупри 25 С, Удельная активность связанного фермента составляет 2 оот удельной ак 1 нн. ности раствора фермента,П р и м е р 8. 0,1 г ксерогеля акрилекс Р(сополимер акриламида и М,й -мети 1 лен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл 0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего к полученной суспенэии добавляют раствор 0,25 моль п-бензохинона в 20 - ном растворе диоксана (1,0 мл) и выдерживают суспензию в течение 24 ч при 50 С. Набухший гель отделяют и промывают последовательно 70 мл 20-ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды,Активированный гельотфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему 2,0 мл 0,01-молярного раствора глюкозы в 0,1-молярном растворе калийнатрийфосфатного буфера (рН 7,5). Суспензию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, после чего гель отделяют и удаляют несвязанную глюкозу путем последовательной промывки содержащим 1 моль хлористого натрия 0,1-молярным натрийацетатным буфером (рН 5,0) и 0,1-молярным раствором бикарброната натрия (рН 8,5), Количество связанной глюкозы составляет 6 мкмоль, что соответствует 30 от всего ее количества в Все данные по примерам 1-8 сведены в30 таблицу.П р и м е р 9 (демонстрирует стабильность полученных продуктов). Колонку размером 1,5 х 10 см заполняют 0,5 гиммобилиэованного препарата фермента,35 полученного согласно примеру 6, активность которого составляла 23 ед,Через колонку пропускают в условияхпромышленного процесса при 25 С и соскоростью 12 мл/ч 0,25-молярный водный40 раствор глюкозы. Количество продукта в вытекающем потоке оставалось неизменным втечение 51 дня (1224 ч), Это доказывает. чтофиксированный препарат фермента сохраняет свою активность.45 Применение перепарата инвертаэы,полученного известным способом, для процесса гидролиза показало, что активностьпрепарата падает в течение 100 ч работы,Формула изобретения Способ получения иммобилиэованных нуклеофильных соединений, включающий1 активацию сополимера акриламида с М,М- метиленбис-акриламидом и его взаимодействие с нуклеофильным соединением с последующей промывкой целевого продукта для удаления низкомолекулярных примесей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения стабильности целевых продуктов, активацию проводят путем добавленияЗаказ 3829 Тираж Подписное ВНИИПИ Государсгвенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035. Москва, )К, Раушская наб., 4/5 роизводственг(.из/(ат 1 льский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 к суспензии сополимера в фосфатном буфере с рН 8 раствора л-бензохинона в водном диоксане, при концентрации п-бенэохинона в реакционной смеси 50 ммоль/л, и выдержки реакционной смеси при 50 С в течение 24 ч с последующей промывкой полученного геля, в качесвте нуклеофильных соединений используют у-аминомасляную кислоту, глюкозу, альбумин бычьей сыворотки, глюкоэооксидазу или каталаэу и взаимодействие осуществляют путем добавле 8 50 24 50 8 50 24 50 8 50 24 50 8 50 24 5 О 8 5 О 24 50 8 5(1 24 5 О 8 50 24 5 о 8 50 24 50 ния к гелю активированного сополимера раствора нуклеофильного соединения в буферной смеси с рН 3-9 и концентрациейаминомэсля ной кислоты и Глюкозы 5 0,01 моль/л, а остальных нуклеофильныхсоединений - 20 мг/мл и выдержки смеси при 4 С втечение 24 ч при конечной концентрации у-аминомасляной кислоты и глюкозы 2,5 ммоль/л, а остальных соединений - 10 5 мг/мл,