Способ получения антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грамположительных бактерий

(22) Заявлено (23) Приоркте (31) 269 34/7 2497858/28(32) 2 209 еликобританивллетевь яЪисакия 1808 Государственный комите СССР по делам изобретений н открытий(Итали рмес Па Иностранная фирма руппо Лепетит С,п.А.т т1) Заявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ Изобретение относится к микробиологической промышленности икасается производства антибиотика,обладающего антибактериальным действием,Предлагаемый антибиотик новыйи способ его получения в патентнойи научно-технической литературене описан.Цель изобретения - получениенового антибиотика, обладающегоантибактериальным действием противграм-положительных бактерий. ру да тигается темЬа черсифеоь 1ащивают впитательночники углере соли, с пВОГО ПРОДУКатее во чероДЛЯ ПОЛ Еелен из о%ИаГес,ъ.ь.(селергапогее - ОьйегаЬ"ланды под ноурально-морфШтамм легко уч пр Эта цель дос штамм Зсборсапез Р 30576 выр условиях на содержащей исто та и минеральны выделением целе Штамм Ясбпор С,В.Б. Р 30576 антибиотика вью вблизи багчераг и депонирован в бсср т еЕсоЕ ого ) . Нидер А/13826. Культ кие признаки, что 3 С.ь. ь. аэробных й среде, ода, азооследующим та.гепк 1 з НИЯ НОВОГО бы грунта (Индия) ас Ьцгеаи аа 1 1-Замером ологичес- культивиПаренти, Каролина Коронелмони ется на различных питательных срех. В овсяной муке-агаре колонии имеют диаметр 3-4 мм, неравномерные очертания и шероховатую поверхность. Воздушный мицелий отсутствует. Спорангии образуются на различных агаровых средах, они равномерны и шероховаты, диаметр 13-20 мкм. Зооспоры очень подвижны, шаровидны, иногда немного продолговаты и имеют диаметр 1,5-2 мкм.Культуральные свойства. Солодово- дрожжевой агар: обильный рост, морщинистая поверхность, от оранжевого до коричневого цвета (средняя часть колонии более темного цвета). Овсяный агар: скудный рост, тонкая структура, стекловидного до светло- оранжевого цвета, спорангии. Глицерино-аспарагиновый агар: обильный рост, корковая поверхность, ярко- оранжевого цвета. Пирозиновый агар: умеренный рост, корковая поверхность, оранжевого цвета. Глюкозо-аспарагиновый агар: обильный рост, шероховатая поверхность, ярко-оранжевого цвета, Картофельный агар, Умеренный рост морщинистая поверхность, от оранжевого до коричневого цвета, спорангии.БЬео 1 ососсоь ИаепюГубсцвЯЬрЬцйсоссов ао еоз 0,2 10 01 рсососсць роеопчоп 1 ае 0,4 369065Снятое молоко-агар: обильный рост,морщинистая поверхность, от оранжевого до светло-коричневого цвета,пятнистые тени.Агар Чапека: обильный рост, морщинистая поверхность, оранжевого цвета.Картофель: скудный рост, морщинистаяструктура, темно-оранжевого цвета.Желатина: скудный рост, светло-оранжевого цвета. Физиолого-биохимическиесвойства. усваивает Св - арабинозу,ксилозу, Се-глюкозу, фруктозу, манно.- 10зу, маннит, инозит, рамнозу,сахарову,лактозу.Не усваивает рафиноэу,целлюлозу,специальный салицин.Гидролизует крахмал, казеин, малаткальция.15Сероводород образует, меланин необразует, реакция тирозиназы-отрицательная. Нитраты восстанавливает.Лакмусовое молоко не коагулирует,но пептонизирует, разжижает желатину.оОптимум роста при 30 С в течение6-14 дней.для поЛучения нового антибиотикаштамм культивируют при анаэробных 25условиях в водной питательной среде,содержащей усваиваемые источникиуглерода и азота, а также минеральные соли.ЬОбычно культивируют в качалочнойколбе до тех пор, пока не образуетсясоответствующее количество антибиотика, после чего культуру пересевают на ферментационную питательную среду в вибрационном ферментере. 35После этого продолжают культивировать при 25-35 С при анаэробныхусловиях до тех пор, пока не образуется значительное количество антибиотика. Концентрацию антибиотикаконтролируют в ходе культивированиямикробиологическим путем по методудиффузии в чашке.После отфильтровывания мицелияантибиотик выделяют из ферментационного раствора известным путем, 45как, например, экстракцией органическим растворителем, в котором растворяетея антибиотик, но который несмешивается с водной средой. Экстракцию производят после доведения значения рН фильтрата до 2-4. При этомв качестве растворителей используюталканолы С,-С , алкиловые С,-С 4 эфи"ры низких алйфатических кислот илинизкие галогенированные углеводороды. Растворитель выделяют иэ ферментационного раствора путем центрифугирования при высоких скоростях, концентрируют его до 1/200-1/400 пе 1 1 оначального объема, охлаждают и выдерживают его до тех пор, пока не образуется осадок, который потом фильтруют. Он состоит из очень чистогоантибиотика. Потом маточные растворысобирают и наливают в избыток инертного неполярного растворителя, как,7например, масло, чем получают.еще определенное количество сырого антибиотика, Сырой продукт растворяют в смеси метанола с ацетоном и потом осаждают,из раствора добавлением кислотной воды.Обе фракции соединяют и очищают путем хроматографии на колонке хлороформом и метанолом в качестве системы растворителей.Затем антибиотик перекристаллизовывают из метанола и этилацетата 1:1Антибиотик показывает е ч 1 Ь о о 1 я ч 1 чЬ противобактериальную активность, особенно я ч 1 Ь"о,прежде всего против грам-положительных бактерий. Ниже приведена минимальная ингибирующая концентрация мик), мкг/мл, для различных штаммовЯорИцЬсоссов аоеов ЛТСС 6538 0,025 йорьуЬсоссов аоеов том. 0,025 ЬЬер 1 ососсов ЬаееоЦЬсоь С 203 0,0062 ЪрЬсоссиь рпеоеопще УС 41 О,Я 0078" МОЬЬЧс 6 оа рейг 1 гфепв 1% Ю 4 Ь О, 012 МуорЬыпа фзйверЬсоа НЗ 1 С,г,ь. 0 2,Кроме того, новый антибиотик превосходно действует 1 я ч 1 чо при вызванных экспериментально инфекциях в мышах, Значения ЭД антибиотика, обнаруженные при эксйериментально вызванных инфекциях ЯарИцЬсоссий аоеов, ЬЬ ерЬсоссоь Иаегпоцбсов,ЪрВсоссщ рпеоаопае, сведены в нижеследующей таблице. Новый антибиотик также активен против микроорганизмов, которые устойчивы к обычно употребляемым антибиотикам. Токсичность антибиотика очень низка (ЭД перорально или внутрибрюшинно у мышей 1000 мг/кг),П р и м е р . Штамм 4 сбпорЬпез все"черагепЫь С.3.5. 305 76 предварительно культивируют в питательной среде при значении рН 6-10 до тех пор, пока не образуется значительное количество антибиотика. Культуру выращивают в качалочной колбе на среде следующего состава, г/л: Мясной экстракт 3,0 Триптон 5,0 дрожжевой экстракт 5,0 Глюкоза 1,0 Растворимый крахмал 24,0 Карбонат кальция 4,0 дистиллированная вода (мл) До 1000,Потом колбы встряхивают в течение суток при 28-30 С, после чего 1 л предварительных культур пересевают на вибрационные ферментеры, содержащие 10 л питательной средыследующего состава, г 40 40 10 25 100 500 50 (кя) До 10,Мясной экстрактПептонДрожжевой экстрактХлорид натрияСоевая мукаГлюкозаКарбонат кальцияВодопроводная вода Потом с размешиванием анаэробно инкубируют при 28-30 С. В определенных интервалах по методу диффузии в чашке микробиологически испытывают активность антибиотика с ЙорИцососсць ацеие в качестве подопытного организма. Максимальная активность достигается после 3-4 дней,)О 15 Выделение и очистка антибиотика.80 л ферментационной жидкостифильтруют 1-ным Сйа се (вес. /об. )в качестве вспомогательного средства для Фильтрования. Мицелий выбрасывают и после подкисления отфильтрованного раствора 10 ной соляной кислотой до рН 2,5 егоэкстрагируют два раза этилацетатом,количество которого соответствуетприблизительно 50 объема раствора.Органическую фазу отделяют от водной центрифугированием при высокихскоростях, сушат ее Иа 2 ЯО, концентрируют прн 45-50 С при вакууме до1/300 первоначального объема, и охлаждают до 0-10 С. 35Сырой осадок собирают на фильтре,промывают значительным количествомэтилацетата и сушат в вакууме при45 С. Таким образом получают 1,140 гантибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью чистоты70.Остающиеся после Фильтрации маточные растворы наливают в 20 об./ч,легкого масла и получают еще 2,550 г 45антибиотика с полученной спектроФотометрическим путем степенью частоты 20-25, Это вещество суспендируютв незначительном количестве метанолаи ацетона (9:1). Нерастворимые составные части отфильтровывают, после чегоразбавляют водой, Размешиванием 10 ной Соляной кислотой значение рН раствора доводят до 2,5. Таким образом.полуЧенный осадок собирают центрифугированием и растворяют в минимальном количестве бутанола при темпера-турах 45-50 С. Раствор концентрируютОв вакууме до 1/5 первоначального объема и охлаждают до 4 С. Полученный оса.док собирают и .сушат в вакууме, получают(0,450 г) антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью чистоты 80, Полученные продукты потом продолжают очищать, Дляэтого их растворяют в минимальном 65(85 : 15) и хроматографируют предварительно активированной при 100 Сколонкой ЬЬса - СеМе (1 : 1 об/об.и промывают смесью хлороформа/метанола,Элюирование и тонкослойную хроматографию фракций производят той.же самой смесью. По данным тонкослойной хроматографии собранные Фракцииконцентрируют в вакууме до незначительного объема. После добавки диэтилового эфира образуется осадок, состоящий из антибиотика с полученнойспектрофотометрическим путем степеньючистоты 95 . Осадок растворяют в метаноле и этилацетате (1:1), нагревают до 45 С и фильтруют. После охлажОдения до 4 С и .выдерживания в течение ночи при той же самой температуре получают чистый антибиотик в видесветло-желтых игол,Химико-физические свойства антибиотика.Антибиотик представляет собойпорошок светло-желтого цвета, кристаллической структуры и кислотногохарактера. Анализ кислотного гидролизата антибиотика в 6 н.солянойкислоты в герметнчески запаяннойтрубке при 110 С показал 4 аминокислоты, три иэ которых в аминокислотном автоанализаторе были определены как аспарагиновая кислота,треонин и глицин. Точка плавленияантибиотика 210 ОС. Элементарный анализ, :С 51,35 Н 5,05 у И 10,50 у Я 11,05)О (при помощи разности) 22,05,В ультрафиолетовой области видимыеспектры поглощения:(плечо)236. Растворитель мсикс 0,1 н, НСто жето жебуфер 0,15 М(рНто жето жето жебуфер 0,15 М(рНто жето же 360 290 237 7,5)408378 290 237 8,8)408290 238 Ультрафиолетовые спектры поглощения устанавливают с помощью ультрафиолетового спектрофотометра в растворах с буфером метилцеллозольва (1:1) при различных значениях рН.Антибиотик содержит сильно флуоресцирующий хромофор. Раствор активированного при 240 нм продукта в 0,1 н растворе едкого натра показывает эмиссионный спектр с максимумами при 355 и 490 нм.Спектр флуоресценции был установлен с помощью спектрофотометра флуоресценции.б 80657 Составитель С.МалютинаТехред Э,Чужик КорректОр С. Шекмар Редактор Н.Потапова Заказ 4657/59 Тираж 526 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб.,дф 4/5Филиал ППП ффПатентф, г.ужгород, ул.Проектная,4 Характерные полосы поглощения в ньюеле были установлены при следующих частотах (см г )г3400 (плечо), 3350 (сильно), 3200 (плечо), 3100 (сильно), 2930 и 2870 (ньюель), 2800-2400, 2380 (атмосферная двуокись углерода), 1750 (сильно), 1670 (сильно), 1620(сильно), 1540 (сильно), 1480 (сильно), 1460 и 1380 (ньюель), 1420 (сильно), 1340 (сильно), 1320 (сильно), 1280 (сильно), 1240 (сильно), 1195 (сильно), 1170 (сильно), 1145 (сильно), 1120 (сильно), 1075 (широко), 1015 (сильно), 990 (сильно), 935 (сильно), 920 (широко), 900 (сильно), 865 (сильно), 840 (сильно), 800 (сильно), 770 (сильно), 755 (сильно)740 (сильно), 720 (ньюель) .Инфракрасный спектр был установлен с помощью спектрофотометра.Удельное вращение:(а = 125 (С=0,8% в метаноле и хлороформе 1: 1). Соединение растворяется в диметилсульфоксиде, диметилформамиде исмесях хлороформа и метанола, малорастворяется в хлороформе, метанолесмесях метанола и зтилацетата, раст"ворах БаНСО и ледяной уксуснойкислоте, не растворяется в воде иостальных общепринятых органическихрастворителях.Предлагаемый способ обеспечиваетполучение антибиотика, обладающего 10 антибактериальным действием противграм-положительных бактерий. Формула изобретения15Способ пол)учения антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грам-положительных бактерий,заключающийся в том, что штаммМиюрЬеб ьагчерог елков с.а,з. Р 30576выращивают в азробных условиях наггитательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральныесоли, с последующим выделением целевого продукта,