433206

(61) За висим ое от авт. свидетел ьства(51) М Кл.С 12 к 1/04 С 12 к 5/00 с присоединением заявки Лl- -Государственный комитет Совета Министраа СССР оо делаи изобретении и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА 2 рН 5,5-5,5 добавлением лимонной кислоты, 1Изобретение относится к спосо- бам получения диагностических препаратов, используемых в ветеринарии для серологической диагностики инфекционных болезней. Известные способы получения антигенов, включадцие выращивание микроорганизмов на альбуминовои питательной среде, обработку культур формалином, осаждение, очистку, например дйализом, и высушивание, не позволяют получить достаточйо активных и специфичных антигенов в необходимом количестве. Для получения специфических и активных антигенов после обработки культур формалином лептоспиры осаждают белком среды, который переводят в состояние геля действием трихлоруксусной кислоты с последующим сублимационным высушиванием осажденной массы, а пе)ред высушиванием устанавлйвают Способ осуществляют следующим 5 образом.Берут эталонные штаммы (илиих аналоги) лептоспир семи сврологических групп и готовят из них моно- и полиантигены (см,1 о таблицу) Перечисленные группы лептоспирвзяты с учетом этиологическойструктуры лептоспироза, у сельско хозяйственных животных в Советском Союзе. При необходимостиантигены могут быть приготовлены рекомендуемым методом из лвптоспир любых других серологичвских групп.Полиантигены готовят в следующих сочетаниях:1 антиген: помона и тарассови,433206 эталонные штаммы 3.П антигон: гебдомадис и гриппотифоза,Ш антиген: иктерогеморрагия,каникола и батавия. Аля приготовления полиантигенов культуры лвптоспир соответствующих серологических групп с одинаковым накоплением бактериальной массы смешивают в равных соотношениях и обрабатывают по методике, принятой для изготовления моноантигенов. Выращивают лептоспиры на альбуминовой среде ГНКИ ветеринарны препаратов МСХ СССР при 2- 28 С в течение пяти-семи дней до максимального накопления бактериальной массы, но не менее 100 ма о микробных тел в 1 мл среды. Содержание альбумина в среде 0,2 г/.Непригодны для получения анти- генов культуры, загрязненные постороннеи микрофлорой, не типичные по морфологии, лизирующиеся, с признаками самоагглютинации.зо Серогруппы лвптоспир РсеоАаегп бак Ара. 8Са.Мсо 8 а.Роогагг,аЫоо о 1 роАоза.УеЮолрасКуЗаа Ый.ГЬР 33 б 0 в) на центрифуге сепараторного типа при скорости вращения ротора до 15000 об/мин производительность до 50 л/час. Ценрифу гирование проводятпри 1-5 С Осадок разводят дистиллированной водой в 20-25 раз в зависимости от концентрации лептоспир в исходной культуре и помещают по 100-200 мл в диализационные мешочки. доля диализа используют Вольфенскую вискозную кишку производства ГДР. 4Культуры проверяют на чистоту и интенсивность роста путем просмотра баллонов в проходящем свете и раздавленных капель в темном поле микроскопа. Охлаждают отобранные культуры до 1-5 С,добавляют нейтральный Формалин до концентрации 0,25 в пересчете на 40-ный формальдегид),пср дмешивают и выдерживают в течение 18-2 М час при 1-5 С. Приливаю к формалинизированной культуре при постоянном перемешивании насыщенный раствор трихлоруксусной кислоты до 2,5 Я ной концентрации в среде. Отделяют осадок от надосадочной жидкости центрифугированием при одном из следующих режимов:а) на центрифуге с угловым ротором при 5000 оо/мин в течение 5 мин; б) на центрифуге с горизонтальным ротором при 5000 об/мин в течение 5 мин; ц(0 атоюи Яа со гг/ б-А 3 У йРБа.и, 7 ГВЮРЕЬЕ Ь-е Юс" а. Диализ воедут в проточной воде при 1-10 С в течение трех-четырех суток до перехода альбумина в состояние золя при рН 5,5- Ф,5 и последующего выпадения в осадок в изоэлектрической точке при рН 4,7-1,8. ,опустимо смещение рН до любых значений в пределах ь,5-7,0.Добавляют к полученной после диализа массе по каплям 10 Б-ный раствор лимонной кислоты до установления рН 5,5-5;5,Испытывают приготовленные моно- и полиантигены на активность1 О 15 2 О 55 5и специфичность с агглютинирующими групповыми сыворотками в реакции макроагглютииации на стекле и на самоагглютинацию - с физиологическим раствором. Уоноантигены считают активными, если го:,:олог 1 чная сыворотка с титром до 1: 10000 не разведенная и разведенная 1:5 и раскапанная по 0,04, 0,02, 0,01 и 0,005 мл вызывает во всех случаях агглютина цию не менее, чем на три креста. Специфичность антигенов проверяют с гетерологичными лептоспирозными сыворотками. Антигены из лептоспир серологическ 1 х групп тарассови, гриппотифоза, батавия и гебдомадис не дают перекрестных реакций. допустима агглютинация, как и в реакции микроагглютинации-лизиса, у антигена помона с сывороткамй каникола и иктерогеморрагия, у антигена иктерогеморрагия - с сыворотками каникола и у антигена каникола с сывороткои иктерогеморрагин. Агглютинация в этих случаях наступает в первых 1-5 каплях неразведенной сыворотки при активности реакции в 1-5 креста. Для исключения самоагглютинации каплю анти 1 ена смешивают с каплей физиологического раствора. В этой смеси не должно быть хлопьез и зернистости,Полиантигены считают активными, если каждая из гомологичных сывороток к лептоспира 11, входящим в состав антигена, раскананная по 0,04 и 0,02 мл, агглютинирует полйантиген на 2-5 креста в ооаих каплях. Препарат, признанный активным и специф 4 чным, разливают в ампулы по 2 мл и высушивают методом сублимации по следующим режимам: замораживают нтиген до минус 40 - минус 45 С и выдерживают заданную температуру в течение, 2-3 час; устанавливают вакуум в 100 мк рт.ст., включают подогрев и выравнивают температуру па всех зтажах камры повышают температуру в кайзерев течение каждого часа на 2-5 С 25 Зо 35 4 О 45 50 6до темпа" атуры Инус 10 С на 1 ОС 0 ти"1 ус .0 До 10 С.и на 2-5 С рт 10 до 25 С. цосушивают при 25 С в течение 2 час. Проверяют высушенные антигоны на активность и специфичность по той же методике, что и перед сушкой,Хранят антигены при 0-10 С,о Срок годности препарата при соблюдении условий хранения не менее одного года. 11 атод;1 а постановки и учетареакции следующая. Растворяют сухие антигены физиологическим раствором. Быораковывают ампулы с неполностью растворившимся препаратом или содержащие хлопья,Ставят реакцию при коВатной температуре на стеклянных пластжх с квадратам 9-1 б см .Исследуемую сйворотку раскапывают в три квадрата по и,Ь 4 мл и добавляют к каждой кайле по 0,04 мл полиантигана. Сыворотку с полианти ген О смешивают стеклянной палочкой, а затем покачиванием стекла.Учитывают реакцию в проходящем свата испоьзуя осветитель типа О,41-1, Оценивают реакцию в крестах по четырехбалльной сис 20 ми,Каждую сыворотку, вызвавшую агглюти 1:.ацию полиан тй гена, исследуют с 1 Оноантиганам, входящими в состав данного полиантигена, по той же методика. 11 рнеобходимости оп 1 аа л;ть титр сыворотки неазведанную и разведанную 1:5, :25 и 1:125 сыворотку 1 аскапйвают по 0,04, 0,02, 0,01 Й 0,005 мл и добав яют к каждой капле по 0,04 мл антигена. Учитывают реакцию в срок до 10 мин. Агглюти 1 ация не менее чем на два креста свидетельствует о наличии лаптоспирозных антител в исследуемой сыворотке. для постановки диагноза достаточно выявления антител в первой капле. 1 о раакпии макроагглютипации можно исследовать свежие и консар вированныа фанолом ил, Оорной кис" лотой сь 1 воротки9 МЗбаПРЯМЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯ тигенов, после обработки культурформалийом лептоспиры осаждают1. Способ получения антигенов оелком среды, который переводят вдля дйагностики лептоспироза вклю состояние геля действиемчающий выращивание микрооргайизмов уксусной кислоты с последуюмана альбуминовой питальной среде, 5 сублимационным высушивандем Осажобработку культур формалином,осаж- "денной массы,дение, очистку, например, диализом , 2. Способ по п.1, отличающиЙи сублимационное высушивание, от- .ся тем что перед выстличающийсЯ тем, что, с целью пОлУ- Устанавливают РН 5,5-5 5 од выстшиванивмЧЕНИя СПЕцИфИЧЕСКИХ И аКтИВНЫХ аН О НИЕМ ЛИМОННОИ КИСЛ Ы а ДО аВЛЕФСоставитель Бе МИИХОВ Редактор Й ПИЕЧук Техреду БОРИ-ОуД Корректор Л .ЦЯДЬКОВ,Г заказ ЪВЧ СИзд.Я 1 Тираж Ф 56ПодписноеЦ 11 ИИ 1 И Государственного комитета Совета Министров СССРо делам изобретений и открытийМосква, 113035, Раушская наб., 4/Предприятие аПатент, Москва, Г.59, Бережковская наб., 24