Способ определения вирулентности штаммовбруцелл

ОПИСАНИЕ 23 Ю 64ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Содиэлистических Республик,фФ;Щ 3а); Зависимое от авт, свидетельстваЗаявлено 17.Ъ,1967 ( 1158121/30-15) Кл. 301 т, 6 с присоединением заявкиПриоритетОпубликовано 15.Х 1.1968. Бюллетень35 Дата опубликования описания 17.111.1969 МПК А 611 Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРУДК 619;578.088,1:576.8. .097.21:576.851,42 (088.8) Авторыизобретения К, П. Студенцов и Б. Ф. Резников Заявитель Карагандинская научно-исследовательская ветеринарная станция СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛОпределение дезамииазиой активности у бруцеллИзвсстные способы определения вирулентности (степени патогенности) болезнетворных микроорганизмов, например бруцелл, не позволяют определять вирулентность микроорганизмов без заражения подопытных животных.Предложенный способ отличается тем, что с целью быстрого определения вирулентности без использования лабораторных животных вирулентность шгаммов бруцелл определяют путем сравнения активности их ферментов - 10 уреазы и дезаминаз. Активность уреазы определяют при оптимальных условиях на желатиновой среде, содержащей только один субстрат, ферментируемый бруцеллами, а именно - мочевину. Активность дезаминаз определяют 15 по степени подщелачивания питательной среды, не содержащей мочевину.По предложенному способу вирулентность бруцелл определяют не на животных, а на основании биохимических свойств бруцелл 20 т. е. по способности бруцелл образовывать аммиак при гидролитическом расщеплении мочевины под действием уреазы и дезаминировании аминокислот питательной среды под действием дезаминаз. 25Перед определением активности дезаминаз и уреазы культуры исследуемых штаммов необходимо проверить на диссоциацию по реакции тсрмопреципитации и агглютинации с трипафлавином. При обнаружении признаков дис социации необходимо произвести рассев и проводить дальнейшую работу с культурами, находящимися только в Б- или в К-форме, ноне в смешанной (ЬК). Принцип метода основан на изменении в щелочную сторону рН среды в процессе роста культур бруцелл, наблюдаемом под контролем фенолового красного индикатора. Чтобы избежать подщелачивания за счет мочевины в мясной воде и,поченочном экстракте, последние выдерживают 15 - 20 час с кристаллической уреазой,Приготовление среды. Отмеривают 1 л мясной воды (1: 2); 0,3 л печеночного экстракта (1:1), приготовленных из мяса и печени молодой говядины, 10 г сухого пептона, 65 г кристаллической уреазы и 13 мг фенолового красного индикатора. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения всех ингредиентов и оставляют на 15 - 20 час при 5 - 8 С.После выдержки к смеси прибавляют 5 г поваренной соли.и устанавливают рН 7,6 - 7,8. Затем добавляют 30 г сухого агар-агара, и всю смесь автоклавируют при 1 атм (120 С) в течение 45 мин, после чего оставляют в авгоклаве для декантирования. Когда среда остынет, осадок срезают и удаляют.После растапливания среды текучим паром к ней добавлЯют 1 в/в глюкозы, 2 оо глицеРина и устанавливают рН 7,1 - 7,2. Затем среду разливают по 5 мл в пробирки с ватными пробками и стерилизуют 30 мин под давлением 0,5 - 0,7 атм (110 - 115 С). Пробирки должны быть подобраны одного диаметра и сорта стекла.Готовая среда в толстом слое должна иметь оранжевый цвет, а в одной пробирке - желтый, с конечной рН б,8 - б,9.Пробирки со средой скашивают так, чтобы среда покрывала только дно пробирок и оставляют в горизонтальном положении на двое- трое суток при комнатной температуре для подсушивания.На подсушенные среды производят обильный посев штаммов бруцелл. Для этой цели берут полную петлю (Д = 2 мм) бактериальной массы бруцелл с двухсуточной агаровой культуры и равномерно распределяют по всей поверхности МППГГА с индикатором. Каждый штамм бруцелл засевают, параллельно на две пробирки. Культуры выращивают в течение двух суток в термостате при 37,5 - 38 С во влажной атмосфере (в термостат ставят сосуд с водой). При этом нужно следить, чтобы в помещении не находились летучие кислоты и основания.Выращенные 48-часовые агаровые культуры бруцелл выдерживают в течение 1 - 2 час в холодильнике при 5 - 8 С, после чего производят учет степени подщелачивания среды. У штаммов бруцелл, давших плохой рост на МПГ 1 ГГА с индикатором (менее б млрд, микробных тел на 1 мл среды), степень подщелачивания не учитывают, и они вновь пересеваются.Оценка активности дезаминаз основана на способности каждого штамма бруцелл к максимальному подщелачиванию МППГГА и ведется по пятибалльной системе:0 - нет изменения цвета среды,посравнению с незасеянной пробиркой;+ - слабо-оранжевый цвет среды;- оранжевый цвет среды;- красный цвет среды;- малиновый цвет среды с фиолетовым оттенком.К о н т р о л и. Для проверки правильности приготовления данной серии среды перед массовым исследованием штаммов бруцелл ставят ее контроль, С этой целью засевают пять жтаммов бруцелл на две-три пробирки каждый, обладающих различной активностью дезаминаз и не изменяющих своих свойств при многократных пересевах:1. Вг. аЬог 1 цз Лента (вирулентный КазахНИВИ)2. Вг. зц 1 з 1330 (эталон- .+ный)10 15 20 25 5. Вг. аЬог 1 цз Определение уреазной активности у бруцеллПринцип метода основан на изменении рНсреды в процессе гидролиза мочевины поддействием уреазы бруцелл на аммиак и углекислоту, Скорость подщелачивания среды засчет аммиака служит мерой активности уреазы штаммов бруцелл. Учет скорости подщелачивания среды ведут под контролем фенолового красного индикатора до полного изменения цвета среды от лимонно-желтого до малинового.Определение активности уреазы у бруцеллпроизводят на жидкой желатиновой среде, содержащей только один ферментируемый бруцеллами субстрат - мочевину,Приготовление среды. В колбе на кипящейводяной бане в 1 л дистиллированной водырастворяют 20 мг фенолрота и 10 г желатины.После того как вся желатина растворится,колбу ставят непосредственно на огонь, доводят до кипения, затем снимают с огня и плотно закрывают пробкой,В отдельной колбе из однозамещенного фосфорнокислого калия и двузамещенного фосфорнокислого натрия приготовляют 1/15 Мбуфер с рН б,8.Для,приготовления 1 л среды к 950 мл раствора желатины с фенолрот (температуракомнатная) прибавляют 50 мл 1/15 М фосфатного буфера, доводят до кипения и кипятят наочень слабом огне 2 мин. После этого колбуснимают с огня и, не давая остыть жидкости,быстро растворяют в ней 20 г мочевины, всыпая последнюю небольшими порциями. Кактолько вся мочевина растворится, плотно закрытую корковой бробкой колбу со средой 30 35 40 45 50 55 6065 19 (вакцин-ный)4. Вг. гпеИепз 1 з - 1 (вакцин- + + +Кеч ный Эльберга)544 (эталон- ,+ + + +ный)и две пробирки со средой оставляют при техже условиях не засеянными.П р и м е ч а н и е. При отсутствии в лабораторииназванных штаммов можно подобрать штаммы из числа имеющихся с нужной активностью дезаминаз, кото.рая не меняется при многократных пересевах.Если на данной серии среды контрольныештаммы хорошо растут и получены четкиеконтрольные результаты, на нее засеваюгисследуемые штаммы бруцелл, При этом двухсуточные культуры контрольных штаммовпринимают за колориметрические эталоны приоценке активности лезаминаз у исследуемыхштаммов бруцелл. Причем данные колориметрические эталоны относят только к данной серии среды,Для получения более достоверных результатов активность дезаминаз у всей, партииисследуемых штаммов бруцелл следует определять не менее трех раз и на одной сериисреды,раллельно с определением активности деза. миназ,Контроли. При проведении каждой серии анализов рекомендуется ставить следующие контроли.Для проверки правильности приготовления среды следуе брать эталонные штаммы бруцелл с заведомо известной активностью уреазы: Вг. зц 1 з1330, полностью изменяющий цвет среды в среднем за 25 мин , и Бг. аЬог 1 цз544, не обладающий уреазой и не изменяющий цвета среды на протяжении всего срока наблюдения (О),Для контроля стерильности компонентов к 1 мл физиологического раствора, на котором готовились взвеси бруцелл, добавляют 5 мл среды, При этом в течение 24 час выдерживания в термостате не должно наблюдаться ,покраснения среды.У высокоактивных штаммов бруцелл активность уреазы может колебаться при повторных определениях в пределах 10 мин, у слабоактивных - в пределах 20 мин. Величину степени вирулентности штаммовбруцелл определяют по разности между величиной активности уреазы и величиной активности дезаминаз, выраженных в одинаковыхусловных единицах:Вирулентность = + (уреаза - дезаминазы),Чем больше разность между активностьюуреазы и дезаминаз, тем выше вирулентностьштамма бруцелл. При положительной разности между активностью ферментов вирулентность штамма бруцелл зависит от активностиуреазы, при отрицательной - от активностидезаминаз,П р и м е р 1. Например, у эталонного штамма Вг. ьц 1 з1330 активность уреазы составляет + + 4- +, активность дезаминаз +,следовательно еговиру л ентность =- (+ + + + ) - (+ ) =П р и м е р 2, У вакцинного штамма Вг.аЬог 1 цв19 и активность уреазы и активность дезаминаз составляет , следовательно еговирулентность =-= 0П р и м е р 3, У эталонного штамма Вг.аЬог 1 цз544 активность уреазы составляетО, а активность дезаминаз , следовательно еговирулентность = (О) -== -Описанный способ позволяет быстро и с достаточной достоверностью о,пределять вирулентность штаммов бруцелл, например, при дифференциации эпизоотических штаммов ог вакцинных, при отборе и подборе вакцинных штаммов, при изучении направленной изменчивости у возбудителя бруцеллезной инфекции в медицинских и вегеринарных учреждениях,60 65 остужают под краном. По остывании среда готова для работы,При комнатной темгературе готовую среду и раствор желатины с индикатором хранить нельзя. При гемперагуре О+ 5 С готовая среда сохраняется до пятнадцати дней, раствор желатины с индикатором - до сорока пяти дней. Признаками непригодности среды служит изменение первоначального цвета индикатора н разжижение желатины.Необходимое оборудование:стерильные пипетки на 2 мл. Для каждого штамма бруцелл заготавливается отдельная пипетка;стерильные пробирки (1,5 Х 15 см) должны быть подобраны одного диаметра и сорта стекла. Особенно тщательно должны быть подобраны пробирки для приготовления одно- миллиардных взвесей бруцелл, которыми следует пользоваться во всех последующих анализах;стсрильная бюретка на 50 - 100 мл.Ход анализа.На стерильном физиологическом растворе по бактерийному стандарту мутности для паратифозных бактерий готовят одномилличрдные взвеси штаммов бруцелл и разливают по 1 мл параллельно в две пробирки. Затем во все пробирки добавляют из бюретки,по 5 мл желатиновой среды, содержимое пробирок перемешивают и пробирки ставят в термостат при температуре 37,5 - 38 С. Содержимое пробирок после смешивания взвеси бруцелл со средой должно быть лимонно-желтого цвета,Учет реакции ведут в течение первых 3 час с момента смешивания взвеси бруцелл со средой и затем через 24 час выдерживания в термостате,Оценку уреазной активности производят по пятибалльной системе: полное изменение цвета средыв течение 1 час. полное изменение цвета средыв течение 2 час, полное изменение цвета средыв течение 3 час,полное изменение цвета среды более 3 час. 0 - нет изменения цвета среды через 3 час и не отличается от контроля через 24 час выдерживания в термостате.Во избежание субъективизма в оценке конца реакции готовят колориметрический эталон: в пробирку с 1 - 2 г хлористого аммония добавляют 0,01 н. раствор едкого натра (калия) с 0,002 г оо фенолрота до появления стойкого малинового окрашивания с красным оттенком (раствор едкого патра с индикатором в такой же пробирке имеет фиолетовый оттенок); б мл готового раствора отмеривают в пробирку и запаивают, Цвет приготовленного таким образом эталона очень стоек и не меняется при длительном хранении,Определение активности уреазы ведут па 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Определение вирулентности у бруцелл231064 Предмет изобретения Составитель А. Леонов Текред Л. Я. Левина Корректор С. ф. Гоптаренко Редактор В, Торопова Заказ 287/8 Тираж 530 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Центр, пр, Серова, д. 4 Типография, пр, Сапунова, 2 1. Способ определения вирулентности штаммов бруцелл, отличающийся тем, что, с целью быстрого определения вирулентности без использования лабораторных животных, вирулентность штаммов бруцелл определяют путем сравнения активности их ферментов - уреазы и дезаминаз. 82, Способ по п. 1, отличающийся тем, чтоактивность уреазы определяют,при оптимальных условиях на желатиновой среде, содержащей только один субстрат, ферментируемый 5 бруцеллами, а именно - мочевину.3 Способ по п. 1, отличающийся тем, чтоактивность дезаминаз определяют по степени подщелачивания питательной среды, не содержащей мочевину,