Способ получения синтетической вакцины против ящура

; ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(72) Карл-Хайнц Висмюллер, Гюнтер Хесс игюнтер Юнг (ОЕ))(56) ЕР М 0204480, кл, С 07 К/00, 1986, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИНТЕТИЧЕ;СКОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА Изобретение касается способа получения вакцины против ящура,Несмотря на наличие различныхсредств для прививки, ящур в животновод, стве приводит к большим потерям. Одной из ,причин заболевания ящуром в настоящее время является ненадежность классических , прививочных средств (вакцин), которые со) держат умерщвленные или же инактивированные вирусы ящура (МКЯ-вирусы),Инактивирование вирусов иногда происхо.дит неполностью что может служить причи ной "пост-вакцинной" вспышки ящура,Этой опасности нет у синтетических , МКЗ - вакцин, так как в них будут приме, няться тольКо частичные последовательно:.сти определенных вирусных протеинов, : которые не обладают функциями интактныхвирусов.Было найдено, что при применении мембранных якорных соединений и опреде ленных парциальных последовательностей(57) Использование: ветеринария, получение вакцин против ящура. Сущность изобретения; Осуществляют взаимодействие парциальной последовательности вируса ящура ЧР 1(135-154) серотипа О с якорным соединением - мембранным липопротеионом. Якорное соединение выбирают из группы В.5, - или смеси В,5 - и, В,В диастереомеров й - пальмитоил - Я - (2,3-(биспальмитоилокси(-пропил)-цистеинил-серил-сери на или его сукцинимидного эфира. 1 з.п. ф-лы. МКБ - вируса могут быть получены особенно активные МКЯ - вакцины, В немецкой выложенной заявке ДЕ 35 45 150 А в качестве одной из многих возможностей применения мембранно-якорных коньюгатов активных веществ упоминается и получение синтетических вакцин, однако, при этом не следует ожидать, что коньюгаты мембранных якорных соединений и парциальных последовательностей МКЯ - вируса (коньюгаты мембранноякорных и активных веществ) будут показывать необыкновенную эффективность при применении относительно. небольших количеств вакцины.Далее оказалось, что указанные вакцины неожиданным образом отличаются тем что они уже после одноразового примене ния обеспечивают достаточную вакцинацию. По сравнению с обычными (традиционными) вакцинами их преимущество к тому же заключается в том, что они могут сохраняться практически неограниченное время без охлаждения.В качестве парциальных последовательностей МКЯ-вируса, которые связаны с мембранными якорными соединениями, могут быть представлены самые различные парциальные последовательностипэрциальнаяпоследовательность - (134-154)31 40- (135 - 154)- (134 - 158)- (134-160)- (141 - 160) 45- (200 - 213)- (200 - 210)- (161 - 130) причем могут применяться последовательности всех известных серотипов и субти пов,Наиболее пригодны синтетические вакцины, которые состоят из смеси пептидов различных серо-и/или субтипов ящурного вируса, которые смотря по обстоятельствам 55 ковалентно связаны с мембранными.соединениями.Наиболее предпочтительны такие синтетические вакцины, которые состоят из смеси последовательностей ЧР134-160 Следовательно, цель изобретения - этосинтетическая вакцина от ящура, отличающаяся тем, что вакцина состоит из конью гата по крайней мере одногомембранно-якорного соединения и по 5крайней мере одной парциальной последовательности протеина вируса ящура.Мембранные якорные соединения - этосоединения, которые включены в биологические или искусственные мембраны, 10Наиболее предпочтительными мембранно-якорными коньюгатами активныхвеществ будут те, у которых мембрэнноякорное соединение и активное вещество,то-есть парциальная последовательностьМКЯ - вируса, ковалентно связаны друг сдругом.В качестве наиболее пригодных являются такие мембранно-якорные коньюгаты активного вещества, у которых 20мембранно-якорное соединение липопротеин,Эти липопентапептиды могут бытьпредставлены также как мембранные якорные соединения в сокращенной форме (липоди-, липотри- или липотетрапептиды).Наиболее предпочтительными являются К -пал ьмитоил - Я - (2,3/биспальмитоилокси/пропил - цистеинил - серин - серин (Ращз Суз- Яег - Яег (К - пальмитоил-Я (2,3-/биспальмитоилокси/ - пропил) - цистеинилсерил-глицин и М - пальмитоил - Я-(2,3 -серотипов О,А,С,связанных с мембранным якорным соединением й-пальмитоил-Я-(2,3- биспальмитоилокси/пропил)-цистеинил-се рил-серин,При применении последовательности 134 - 154 серотипа 0 и последовательности 134-155 серотипа А, поскольку они содержат С - терминальный лизин, они могут через я - аминогруппы ковалентно связываться с мембранными якорными соединениями,Наиболее пригодными показывают себя синтетические вакцины, изготовленные согласно изобретению, которые содержат парциальную последовательность МКЯ - вируса ЧР /1/ 135-154/,Особенно предпочтительной является вакцина, состоящая из М - пальмитоил - Я - (2,3- биспальмитоилокси/ - пропил - цистеинил - серил - серил - ЧР 1/135-154/, то есть соединение ниже следующей формулы. 3 л"9 туг Авь АЬл -др у 19 г Ч/ Аас=о Г он 2-н-сн сн -сн В 2 1 2 2 ГсьМЦ Ьцз11 .с-о с=о о: 159Мембранные якорные соединения могут принципиально существовать как В, Я. - , В, й - диастереомеры или как смесь диастереомеров. Однако, во всяком случае, было установлено, что вакцины, которые содержат Я, й - диастереомерное мембранное якорное соединение, показывают наиболее высокую эффективность.Согласно изобретению предмет изобретения - это способ изготовления синтетической вакцины, отличающийся тем, что парциальные последовательности МКЯ - вируса посредством коньюгэционной реакции будут связаны с мембранным якорным соединением. Конъюгационной реакцией может быть конденсация, присоединение, замещение, окисление или образование дисульфидэ.Предпочтительные конъюгационные методы отмечены в примере 1,П р и м е р 1, Коньюгация пептидов (протеинов с Равз СУЯ - Яег - Яег-ОЯо - или же Рап 1 зСуз Яег - Яег-ОН1. Пептиды и протеины (2 ммоль пептид/протеин) растворяют в 0,5-1 мл ОМР, ивводят 8 моль (9,2 мг) твердого РащзСуз -55 ег - Яег-Озо. Посредством легкого нагревания и облучения ультразвуком получают гоногенную смесь в виде раствора иобавляют 4 ммоль органического основания (И-этилморфолин), После перемешивания в течение 12 ч, добавляют 1-2 мл смеси1 хлороформ; метанол (1:1), после чего происходит охлаждение в ледяной ванне в течение 2 ч,Осадок промывают в 1 мл холодного х ороформ: метанола (1;1), помещают в с есь третбутанол (вода (3:1), (возможна обработка ультразвуком) и лиофилизуют.2. Пептиды и протеины (2 ммоль пептид ( ротеин) растворяют в 0,8 мл воды и смеивают с 4 ммоль (4,5 мг) РапзСоз - Яег - Яег-ОН, Как правило осуществляется о новательная обработка ультразвуком до т х пор, пока не образуется эмульсия и не у тановится значение рН в пределах от 5,0 д 5,5, После добавления 5 мг ЕДС(1-(3-диметилам и но-пропил)-3-этил-карбодиимидг дрохлорид) растворяется в 100 мл Н 20, 3 тем в течение 18 часов при комнатной т мпературе осуществляется перемешиван е и в заключение дважды осуществляется д ализ каждый с 1 л дистиллированной Н 20. С)держание диализного продукта лиофилиз ют.П р и м е р 2. Разделение диастереомер в от И-пальмитоил-Я-(2,3-(бис-пальмитоил кси/пропил-цистеин-третич, -бутилэфир ( апзСуз-ОВ цт):2 г РапзСуз-ОВ ш растворяют в 10 мл р створителя, дихлорметан (уксусный эфир) 2 ;1 (и помещают на колонну (длиной 120 с, диаметром 4 см) с М И-силигагелем 60, О, 63 - 0,2 мм (70 - 230 тези АЯТМ,При скорости каплепадения 2 капли / ек собирают 350 фракций по 10 мл каждая а иквоты каждой фракции проверяют хром тографией на силикагель - 60 - пластинах в ихлорметан /уксусном эфире(20;1), а такж на окрашивание с помощью хлор-ТДМ р актива на РатзСцз - ОВт,Фракции 280 - 315 содержат В, В-диа тереомеры. Фракции 316-335 - это смесь и В, В - ой, Я, э фракции 336 - 354 Это В, Я иастереомеры от РатзСуз-ОВм,После в паривания растворителя на ротационном и парителе ипомещения остатка в теплый т етич, - бутанал и лиофилизации получают 6 Омгй, В - ,370 мгсмесииз В, В-и В, Я-и 5 0 мг В, Я-РапзСуз-ОВш,П р и м е р 3. Синтез И-пальмитоил-Я- (2 3-биспальмитоилокси)-пропил)-цистеин - и -серил-серил-ЧР (145-154) ЧРпептидная и следовательность МКЯ - вируса серотипэ О К синтезируют через синтез пептида в твердой фазе. Для этого используют Гпос,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 аминокислоты и следующие защитные группы боковых цепей:лизин (Вос), гистидин (Гпос), аргинин (М 1 г) серин (тВц. аспарагиновая кислота (ОтВц), тирозин (1 Ви).Исходя из 1 г и-бензоилоксибензиловой спиртовой смолы и добавления Р мос -уз (Вос) - ОН (0,47 ммоль/г), проводят следующие циклы синтеза, описанные ниже. И- активация с 55 пиперидина в И-метилпирролидоне (1 х 2 мин, 1 х 5 мин), преактивация Ртос - А-А-ОН (1,5 ммоль) в И-метилпирролидоне (6 мл) с диизопропилкарбодиимидом (1,5 ммоль) и 1-гидроксибензотриазолом (1,5 ммоль) с последующим соединением в течение 1,5 часов. После промывки И-этилморфолином (50/, И-метилпирролидоне) преактивацию и соединение повторяют. Блокирование не замещенных аминогрупп проводят посредством ацетоангидрида (2,5 ммоль) и диизопропиламина (1,2 ммоль) в И-метилпирролидоне,После каждого этапа пептидная смола многократно промывается И-метилпирролидоном, дихлорметаном и снова И-метилпирролидоном.После синтеза смолообразной МВЯ-вирус-последовательности часть пептида получают посредством расщепления трифторуксусной кислоты и проверяют с помощью НР С, МЯ, аминокислотного анализа, а также анализа последовательности, После того как 2 группы серина связывают в смолообразный пептид, осуществляется соединение трипальмитоил Я-глицерилцистеина, После 4 часов производится добавление 1 эквивалента И-метилморфолина, а после следующего часа осуществляется промывка липопептидной смолы. Липопептид отделяется от смолы с помощью 2 мл трифторуксусной кислоты (со 100 мл тиоанизола) в течение 4,5 часов. Фильтрат выпаривают, остаток растворяют в уксусной кислоте и вводят в охлажденный эфир. Выпадающий липопептид трехкратно промывают эфиром. Следующую очистку проводят с помощью перекристаллизации из трифторэтанол/ хлороформа в соотношении 1:3 с холодным ацетоном и несколькими каплями воды. Липопептид лиофилизую из трет.-бутанол /воды в соотношении 3:1.П р и м е р 4, Тест на эффективность.Случайно выбранные морские свинки, имеющие вес от 450 до 500 г вакцинируют внутримышечно или подкожно. 0,5 мглиофилизированной вакцины (И-пальмитоил-Я-(2 В, В/ - 1,2-(бис пал ьмитиоилокси)пропил-цистеинил-серил-серил 4(135 - 154) преобразовывают в эмульсию в 500 мл смеси в соотношении 1:1 из 0,05 Мфосфатного буфера и интралипида (В),1836102 Привитые животные не показывают вторичного расстройства функций, в то время как все непривитые животные показывают полную картину ящурной инфекции,Формула изобретения 25 Составитель О. КомароваТехред М.Моргентал Корректор Т. Вашкович Редактор Заказ 2992 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Смесь в течение 10, секунд подвергается обработке ультразвуком,Четыре животных заражают МКЯ-вирусом, в течение 21 дня после вакцинации имподкожно иньекцируются 500 единиц вирулентного ОК ГМД-вируса, вводимого в левую заднюю лапку, В качестве контрольныхживотных привлекают тех, у которых вместовакцины было инъецировано мембранноякорное соединение или же фосфатный буфер. 10У всех зараженных (привитых) животныхбыл найден высокий титр нейтрализирующихантител, составляющийо 91 оЗМэо = 0,36,Контрольные животные не имели титраантител (слепое значение 0,17). 15Титр нейтрализующих антител определялся как логарифм разведения сыворотки,которое необходимо для того, чтобы нейтрализовать на 50% клетки вируса в одном слоеВНК - ВаЬу Нагпэтег Кобпеу - клеток, У 20зараженных животных антитела могут бытьобнаружены посредством антипептиднойпробы Е.15 А (А 4 м), что невозможно в случаенезараженных животных. 1. Способ получения синтетической вакцийы против ящура, включающий ковалентное связывание парциальной последовательности вируса ящура ЧР 1 серотипа 0 с якорным соединением, о т л и ч а ю щ й й с я тем, что в качестве парциальной последовательности берут последовательность вируса ящура ЧР(135 - 154), а в качестве якорного соединения - мембранный липопротеин, выбранный из группы В,З, ЯЯ -или смеси В,Я - и ВЯ-диастереомеров М-пальмитоил-Я 2,3-(биспальмитоилокси)-пропилцистеинил-серил-еерина или еге сукцинимидного эфира.2, Способ поп.1, отлича ющийся тем, что, с целью повышения эффективности вакцины, мембранный липопротеин является В,й-диастереомером,