Способ обнаружения вируса иммунодефицита человека

51) б Коми по и ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ Я т Российской Федерации ентам и товарным знакам к авторскому свидетельс(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСАИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к медицине,предназначено для обнаружения вирусаиммунодефицита человека при использовании культур клеток нейроэктодермальногопроисхождения, а также для поиска антивирусных препаратов, Цель изобретенияповышение чувствительности способа и егоупрощение. Для выявления вируса иммунодефицита человека используют первичные монослойные культуры астроцитов человека на 14 - 16 сутки их роста (п сайго, Культуры сокультивируют с вирусинфицирован,ными клетками крови в течение 20 - 24 ч. Инфицирование проводят путем фагоци тоза астроцитами клеток-продуцентов ВИЧ ) при их соотношении 1:2:3. По появлению многоядерных астроцитов, содержащих вирусспецифические антиген 1, констатируют М наличие вируса. Дополнительно об обнару- д женин инфекции судят по выявлению в астроцитах ДНК-провируса ВИЧ. Визуальное наблюдение специфического цитопатичесокго действия позволяет быстро и просто по сравнению с прототипом обнару- ь жить вирус,Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для изучения репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в куль-урах клеток нейроэктодермального происхождения.Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его упрощение за счет визуального наблюдения специфического действия вируса.Способ осуществляют следующим образом, Источникомполучения культур служит нервная ткань, полушария больного мозга. мозжечка и других, подлежащая удалению при хирургических вмешательствах по поводу черепно-мозговой травмы. Первичные монослойные культуры состоят из 85 - 90% астроцитов. В экспериментах используют Т-лимфобласты линии Н 9, продуцирующие ВИЧштамм 11(линия Н 9/11 В), В качестве контроля берут Т-лимфобласты не инфицированные ВИЧ - 1 (перевиваемая линия клеток Н 9),Монослойную культуру астроцитов выращивают во флаконах объемом 50 мл с четырьмя помещенными на их дно покровными стеклами на их дно покровными стеклами, Подготавливают культуру Т-лимфобластов, хронически инфицированную вирусом ВИЧ - 1 штамм ИВ, и параллельно такую же контрольную культуру без вирусов.- На 14 - 16 сутки роста подсчитывают количество астроцитов во флаконах, удаляют из них культуральную жидкость. в одну часть флаконов (опытные) вносят в 2 мл ростовой среды Т-лимфобласты, инфицированные ВИЧ. а в другую неинфицированные Т-лимфобласты (из расчета на 1 астроцит 2-3 лимфобласта), Ставят флаконы в термостат при 37 С с 5 о -ным содержанием С 02 на 15 мин, затем добавляют в каждый флакон по 3 мл ростовой среды и вновь помещают в термастат.Через 20-24 ч из флаконов удаляют культуральную жидкость, промывают моно- слой 3-4 раза ростовой средой, контролируют в фазово-контрастном микроскопе адсорбцию Т-лимфобластов и их поглощение астроцитами в опыте и контроле, после чего вносят во флаконы по 3 мл этой же ростовой среды и помещают их в термостат.На 5 - 6 сутки после инфицирования констатируют завершенность фагоцитоза в культурах и производят их пересев в новые культуральные флаконы (1-й пассаж).В опытных культурах на 1-м пассаже к 5-7 дню роста отмечают стимуляцию роста астроцитов, проявляющук:ся в более быстром формировании монослоя, На 7-8 день инфицированные и на 14-16 сутки контрольные культуры пересевают на 2-й пассаж(критерием для пересева служит образование сплошного монослоя).О воспроизведении инфекции и обнару 5 жении ВИЧ судят на 2-м пассаже (18-20-йдень после инфицирования) по появлениюмногоядерных клеток (астроцитов), содержащих от 4 до 17 различного размера ядер,в которых обнаруживают вирусспецифиче 10 ские антигены при использовании методанепрямой иммунофлюоресценции и применении поликлональной сыворотки вирусоносителя (ВИЧ - 1). Дополнительно овоспроизведении инфекции судят по обна 15 ружению в астроцитах ДНК-провируса, Используют метод молекулярнойгибридизации, который проводят с 10 мкгхромосомной ДНК астроцитов, используяДНК-зонд плазмиды РЯР, содержащий и не20 содержащей последовательностей ВИЧ,О наличии ДНК провируса в инфицированных астроцитах судят по засветке рентгеновской автографической пленки,П р и м е р 1, Обнаружение ВИЧ в моно 25 слойных культурах астроцитов, полученныхиз ткани затылочной области коры полушарий головного мозга 40-летнего мужчины,инфицированных путем фагоцитоза Т-лимфобластов, продуцирующих ВИЧ - 1 штамм30 11 В,Источником для получения культур клетокявилась ткань мозга (0,3 - 0,5 см), удаленная во время хирургическоговмешательства по поводу черепно-мозго 35 вой травы в 12 культуральных флаконах объемом 50 мл с помещенными на дно 4покровными стеклами готовят монослойныекультуры астроцитов. На 14 сутки подсчитывают выросшее во флаконах среднее коли 40 чество клеток. Устанавливают, что их числосоставляет 800-50 тыс, клеток на флакон.Суспензионную культуру Т-лимфобластов,продуцирующую ВИЧи культуру, не про-дуцирующую вирус, в объеме 3 мл помеща 45 ют в отдельные пробирки и центрифугируютпри 1,5 тыс оборотах в течение 10 мин, Надосадок удаляют. Используя камеру Горячева, подсчитывают количество клеток восадке и разводят их ростовой средой до50 концентрации 1 млн. 200 тыс. кл/мл, Из флаконов с культурами астроцитов удаляют ростовую среду и в каждый из первых 6флаконов вносят по 2 мл приготовленнойсуспензии Т-лимфобластов, продуцирую 55 щих ВИЧ (по 2 млн. 400 тыс, клеток на флакон). Помещают флаконы на 15 мин втермостат при 37"С с 5 С 02, затем добавляют в каждый флаконы по 3 мл ростовойсреды и вновь помещают в термостат. Через24 ч из флаконов удаляют культуральную510 15 20 25 30 35 40 45 50 жидкость, осторожно промывэюг монослой 3 раза ростовой средой, устанавливают в фазовоконтрастном микроскопе факт адсорбции и фагоцитирования астроцитами в опыте Т-лимфобластов. продуцирующих ВИЧ - 1, в контроле Т-лимфобластов, не инфицированных вирусом, после чего вносят во все флаконы по 5 мл ростовой среды и помещают их в термостат. На 6 сутки после инФицирования определяют завершенность фагоцитоза, исследуя в фазово-контрастном микроскопе как монослой эстроцитов во флаконах, так и на покровных стеклах. Последние помещают в фиксатор Дюбокс-Бразиль-Бузна и окрашивают гематоксилином и зозином, После исчезновения крупных внутрицитоплазматических включений и вакуолей констатируют выход астроцитов из фазы завершения Фагоцитоза и производят пересев (посевная доза 70 тыс.кл/мл) на 1-й пассаж. На 1-м пассаже в опытных культурах отмечают стимуляцию роста клеток, в результате чего сплошной монослой формировался уже к 7 дню, в то время как в контрольных культурах его образования завершилось только к 16 дню, После образования сплошного монослоя клеток (в опытных и контрольных культурах) осуществляют пересев культуры на 2-й пассаж. На 2-м пассаже в опытных культурах (18-й день после инфицирования) рисунок монослоя изменяется, клетки располагаются более плотно, появляется 14 + 27 О многоядерных астроцитов, содержащих от 5 до 17 различного размера и Формы ядер. Непрямым методом Флуоресцирующих энтител с использованием поликлональной сыворотки в цитоплазме многоядерных астроцитов выявлены антигены ВИЧ. Методом молекулярной гибридизации, в варианте Дот-анализа с ДНК плазмидой рВН 10, меченной рЛТТФ, в хромосомной ДНК клеток выявлен ДНК-провирус, Много- ядерные астроциты с обнаруженным ВИЧвыявились до 7-8 их пассажа в 100 О, случаев (в 12 из 12 Флаконов с инфицированной культурой астроцитов),Таким образом, при инфицировании астроцитов взрослого человека путем Фазоцитоза ими Т-лимфобластов перевиваемой клеточной линии, продуцирующей ВИЧштамм В, возбудитель обнаруживается по цитопатическому зффекту, проявляющему. ся через 18 дней после инфицирования и заклюцющемуся в формировании много- ядерных астроцитов, содержащих в цитоплазмо вирусспецифические антигены,П р и м е р 2, Обнаружение ВИЧ в монослойных культурах астроцитов, полученных из коры мозжечка 45-летнего мужчины, инФицированных путем фагоцитоза Т-лимфобластов, продуцирующих В ИЧ. штаммВ,Источником для получения культур клеток явилась ткань мозга (0,3-0,5 см), удаленная во время хирургического вмешательства по поводу черепно-мозговой травмы.Монослойные культуры астроцитов приготавливают в 12 культуральных флаконах с помещенными туда 4 покровными стеклами, На 16 сутки роста подсчитывают клетки и устанавливают, что их число на флакон колеблется в пределах 650 + 72 тыс, Затем готовят культуры Т-лимфобластов (2 млн./мл), Культивируют и пересеивают клетки, как в примере 1. На 2-м пассажном уровне в опытных культурах (20-й день после инфицирования) рисунок монослоя астро цитов изменился, клетки стали располагаться более плотно, появилось до 18 + 2 О многоядерных клеток, содержащих от 4 до 16 различного размера и формы ядер. С использованием метода флуоресцирующих антител в цитоплазме многоядерных . астроцитов выявлены вирусспецифические антигены, Методом молекулярной гибридизации в хромосомной ДНК астроцитов выявлены интегративные формы ДНК-провируса ВИЧ. Многоядерные астроциты с обнаруженным в них ВИЧ - 1 выявились в 100;( случаев (в 12 из 12 культуральных флаконов с инфицированнойй культурой астроцитов) до 7-го пассажа. Таким образом, по визуальному наблюдению специфического цитопатического действия ВИЧ его ле ко и просто обнаружить в первичных монослойных культурах астроцитов человека, Появление много- ядерных астроцитов однозначно свидетельствует о наличии ВИЧ в культивируемыхклетках. Простота предлагаемого способа облегчает обнаружение ВИЧ иделает возможным его выполнение и использование в любой диагностической лаборатории.Составитель В.ЛитовченкоТехред М,Моргентал Корректор Н,Милюкова Редактор Н.Козлова Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Заказ 1621 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, улЛ гагарина, 101 7 1797350 . 8Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я системы используют первичные моноСПОСОБ ОБНАРуЖЕНИя ВИРУСА слойные клеточные культуры астроцитов ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА п человека на 14 - 16 сутки роста, заражение их. осуществляют инкубированиемзаражение. клетокщ 5 с клетками продуцентами вируса в соот их и регистрацию инфицирования, отч, а инфицированйе вирусом обнаружиличающийся тем, что, с целью повыше-вают по появлению многоядерных аст ния чувствительности способа и его упрощения в качестве клеток нервной роцитов или по выявлению в астроци 10 тах АНК-провируса ВИЧ,