Способ идентификации viвriо аlвеnsis

ИСАНИЕ ИЗОБРЕТ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ робиология, лабораторная диагностика ЧдЬго а 1 Ьепзя. Сущность изобретения: идентификацию 7 Ъг 1 о а 1 Ьепзя осуцествляют путем совместного инкубирования испытуемой культуры с индикаторным ытаммом. В качестве индикаторного штамма используют штамм ИЬ- гэ.о а 1 Ьепзя КМ, инкубирование проводят в течение 20-24 ч, полученную смесь микроорганизмов прогревают при 55-570 С в течение 40-60 мин, за тем высевают ее на газон индикаторного штамма, посев повторно инкубируют и идентификацию проводят по наличию : Фаголизиса.табл,ударственй противо-у го льск ский Г. о усове светящи Закавк аВК 1 ик- .л торапита- темания,а также симбиотических реакции или реакций ингибиции в смешанных культурах. Отсутствие критериев отбораштамма-индуктора, подбор определенных концентраций культур в смесях, индивидуальные особенности адаптации зре,ния и восприятия интенсивности свече ния затрудняют идентификацию светящихся вибрионов. Применение известного способа создает сложности при исследовании большого количества штаммов, утративших биолюминесценцию в процессе длительного хранения.Целью изобретения является повышение точности способа.Это достигается тем, что к клеточной суспензии Фагочувствительного индикаторного штамма светящихся вибриоСОЮЗ СОВЕТСКИХСО ЦИАЛ И СТИЧ ЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(56) Онацкий И.И., ГрижебоМетодические рекомендациишенствованию идентификациися вибрионов. НИИ Кавказазьл, Ставрополь, 1986,(57) Испол ь зова ние: меди ци Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к лабораторной диагностике 71 Ьгхо а 1 Ьепзв (синоним Ч.рйозрЪогезсепв),Светящиеся вибрионы вызывают диарейные заболевания и обнаруживаются не только у больных людей, но и в объектах окружающей среды. Методы диагностики 71 Ъгдо а 1 Ьепзэ.я разработаны недостаточно. Серологическое типирование не используется из-за отсутствия коммерческих сывороток.Известен способ идентификации светящихся вибрионов, принцип которого основан на том, что при совместном выращивании с испытуемой на свечение культурой в пробирке с пептонной водой индикаторный штамм 7.а 1 Ьепз 1 з индуцирует свечение испытуемого штамма.Однако этот способ основан на выявлениии и ндуци рова нной биолюми несцен" ции, являющейся непостоянным признаом. Свечение индикатора-ин зависит от качества и состав тельной среды, сроков хранен пературы и времени культивирнов засевают идентифицируемый штаммч Ьец 1 я и через 20-24 часа инкубации при 37 реакционную смесь культурпрогревают при 55-57 . Прогретую5взвесь инактивированных клеток наносят на газон индикаторного штамма евиде дорожки. Учет результатов проводят по появлению зоны лизиса фагомспустя 20-24 часа выращивания при 37;1 ОПродукцию фага выявляют при посевеиспытуемых штамиоз с индикаторной, культурой Ч. в 1 Ь",.пя 1 я 1193 С, депонированной в Музее микроорганизмов института "Микроб по номером КМ1(1193 С), На газоне штамма КМ(1193 С) Фаги Ч.а 1 Ьепяя формируютпрозрачные и мутные зоны лизиса, Вкачестве индикаторного штамма можетбыть использована любая нелизогеннаяфа гочу вст вител ь на я кул ь тура ", а 1 Ьепя 1 я. Тест-штамм 7,а 1 Ьепя 1 я 1193 С является универсально фагоцувствительным, поэтому был выбран нами из 11фагочувствительных штаммов. Штамм 25КМ(1 193 С) по большинству морфологицеских и Физиологических характеристик соответствует микроорганизмамвида ЯЬт 1 о а 1 Ьепя 1 я.Культурально-морфологические приз- ЗОнаки,В мазках иэ агароаых и бульонныхкул ьтур, окра венных по Граму, клеткиимеют вид грамотрицательных полиморфных палочек.Подвижные (при выращивании в 0,33щелочном агаре наблюдается помутнение столбика агара).Рост на твердых питательных сре-.юх; на щелочном агаре (рН 7,б,8)вибрионы образуют через 18 часов роста при 37 колонии правильной Формы,диаметром 1,5 мм с влажной; блестящей поверхностью, полупрозрачные впроходящем свете, голубоватые в отраженном.Рост на жидких питательных средах: ,н щелочном бульоне, содержащем100 мкг/мл стрептомицина и без антибиотика, дает помутнение без образования пленки,,50Биохимическая активность штамма:Штамм разлагает глюкозу, сахарозу,маннит с образованием кислоты без газа, не расщепляет маннозу и арабиназу,Декзрбоксилирует лизин, не расщепляет аргинин, не образует сероводород, Штамм устойчив к 50 мкг/мл полимиксинаОтношение к гомо- и гетерологичнымфагам: штамм не лизируется диагностическими фагами, классическим холерными эльтор.ХДФ 3 - отр ХДФ 4 - отр Х,ф 5- отрЛизируется фагами, продуцируемымиЧ.а 1 Ьепя 1 я.Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам; штамм не агглютинируется О-холерной сывороткойи типоспецифическими сыворотками Инаба, Огава.Антигенные свойства штамма: штаммавирулентный для кроликов-сосунковв дозе 10 кл.7Питательные потребности, прототроф(на среде Вхаскарана и Роули растет).Генетические особенности штамма:является стрептомицинустойцивым Фосфоресцирующим мутантом Ч,а 1 Ьепяхя,Продукт, синтезируемый штаммом;штамм продуцирует фермент люциферазу,обеспечивающую в темноте фосфоресценцию колоний и бульонной культуры.При посеве в качестве индикаторного с лизогенными штаммами Ч.а 1 Ьепя 1 явыявляет умеренные Фаги.Активность (продуктивность) штамма; штамм является индикатором дляФагов, образуемых лизогенными культурами, При посеве выращенного в бульоне штамма в слое 0,73 агара по Грация, засеянные в виде "дорожки" фагидают зону Фаголизиса,Штамм светится в темноте Фосфорическим блеском, Выявить свецение можфно после адаптации глаз в течение10 минут. Свеч ние выявляется лучшеу культуры, выращенной в 1 Г пептонной воде, в бульоне Мартена ярче впленке (рН 7,6-7,8) после инкубирования посевов при 37 в течение суток, на агаре Мартена, в полужидкомагаре. На плотных средах периферияпосевов светится ярче в посевах насекторах наблюдается свечение всегосектора.Фагочувствительность штамма определяют по Грациа,при этом вносят 0,5-1 мл 4-часовой бульонной культуры штамма 1193 С в 4 мл 0,7". агара Нарте" на и выливают на агаровую пластинку, затем на газон культуры наносят в виде "дорожки". каплю фага. Штамм-индикатор стабильно выявляет фагопродукцию лизогенных штаммов.Я 88 б 77АктВос .: ." эмьд праверн Гся также при посеве 0,5 мп бульонной культуры в 6 мл 0, Р агара с последующимнанесением на газон индикатора каплинадасадочной жидкости,прагретой при56 О минут бульонной культуры лизогенного цувствительнога к стрептамицину штамма-продуцента ага в виде"дорожки",Способ, условия и состав сред дляхранения; штамм в ампулах в лиофилиозирояаннам состоянии при 4, В полужидком 0,3 й щелоцном агаре при комнатной температуре, на скошенном агаре в пробирках пр комнатной температуре.Способ, условия и состав размножения штамма: Гасев микробной взвесииз ампуль производится на щелочнойагар (рН 7,6-7,8), затем пересевается на щелочной вгао.Условия и состав сред для продукции продуктов жизнедеятельностл клеток; выращивали : щелочном бульоне,щелочнам агаре (рН 7,6-7,8) при 37в течение 2 часов.П р л м е р 1. Готовят взвесьдвух штаммов Ч,а 1 Ьепя 1 я 1193 С и Ч,а 1 -Ьепв 1 я 9504: папетле сутоцньх агаровых культур вносят в одну пробиркус 2 мл бульона артена (рН 7,6-7,8)ои оставляют на 20 часов при 37 . Затем смесь культур прагревают при 55"в течение часа и наносят каплю в ви"де дорожки на га зон штамма Ч, а 1 Ьепздв 1193 С, предварительно засеянногов слое 0,74 агара на пластинку 1,5 Йагарартена,Учет проводят через 2 ч часа выращивания посевов при 37 ф: на месте нанесения капли обоазуется зона просветления газона. Идентифицируемыйштамм 9504 относят к Ч 1 Ь 1 о а 1 Ьепз 1.з,П р и м е р 2. Вьпалняют аналогично примеру 1, но используют дпяпрогревания смеси куль"ур Ч.а 1 Ьепяхв1193 С и 9501 и температуру 56 С в те-цение О минут,П р и м е р 3. Выполняют как описана в примере 1, используя смесьдвух штаммав Ч.а 1 Ьепя 1 з 193 С л 9510.оСмесь культур прогревают при 57 С втечение 60 мин.П р и м е р . 0,5 мл Й-часовойбульонной культуры нелизогеннагоштамма Ч.а 1 Ьепяз 2853 вносят в 5 мл0,73 агара и засевают двухслойным ме"тодом, 1 каплю фагализата 9501 наноб 10 15 20 25 Зд 35 40 45 Г л Г ь сид" дарожю на Галан Ч, 1 Ьс 1"я 1 я 2853, После инкубиравания посевов при 37" в течение 2 ч-л 8 часовучитывают рсзультаты, Яана ливисакультуры .определяет принадлежностьнелизагеннаго штамма 2853 к Ч 1 ЬГ 1 о1 Ъепя 1 я,,ля осуществления такого способаидентификации было изучено 39 штаммовЧ,В 1 Ьепв 1 я (синоним Ч.рюяЬолеясепя)в группу которых вошли та кже два серотипированных штамма Ч.В 1 Ъопвя Р 9501 (серотип 5), Р(сератип 6),предложенные Гальцевой с соавт. дляполучения агглютинирующих сыворотоксветящихся вибрионов.На основании фаголизиса индикаторного штамма светящихся вибрионов былиидентифицированы 15 лизогенных штаммав Ч,а 1 Ьепят.в, три из которых черезгода хранения в столбике агара подвазелинавым маслом утратили способность светиться. 12 штаммов Ч,а 1 Ьепядя не содержал в супернатанте фагов, В связи с этим штаммы были проверены на лизабельность, фагами полученными из культур Ч,а 1 Ьепыв, В таблице представлены результаты повышения числа идентифицирсванньфх штаммавза счет дапалнительнага испытаниядвух фа гав 950 Й и 9510, вьделенныхпо предлагаемому способу из адноименньх штаммов (5 и 6 серотипов соотяетст венно) .1 ак Видно из таблиць ПО предлагае,ому способу идентифицировано27 штаммов, па известному способу 12, т.е. эффективность лабораторнойдиагностики повышается более чем враза.Проведение экспериментов показало, цто фаги Ч.а 1 Ьепздв отключаютсяат холерных и Ч.сЬо 1 егае не 01 группы высокой чувствительностью к хлороформу, Поэтому для инактивации клеток .смешанной культурь используютопрогревание при 55-57 С в течение 4060 минут. Таким образом, способ повышает эффективность лабораторной диагностики Ч,а 1 Ъепз 1 я с положительным и отрицательным феноменом свечения. Он может быть использован при работе с большим набором штаммов Ч.а 1 Ьепя 1 я, не- а г глюти ни рующихся холерными сы воротками и сыворотками к НАГ-Вибрионам, Практическую ценность представляет выделение фагов из штаммав Ч,а 1 ЬепяяФормула и з о б р е т е н и яСпособ идентификации ЧЬгю а 1 Ьепзв путем совместного инкубирования КоличествоизученныхштаммовЯЪго а 1 Ъепвдз Идентификация светящихся вибрионов по предлагаемому способу по известному способу Лизис нелиСвечениештаммов + синруктором -индикатором фагопродукция лизогенными штаммами+ +индикатор зогенных штаммов фа- гами 9504 9510 12 Составитель Т.КудряковаРедактор Л,Павлова Техред И.Моргентал Корректор Н.Слооодяникт итеЮ е4Заказ 4165 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 7 17 9504 и 9510 известных серотипов (5 и 6 серовары), что обеспечивает получение диагностических препаратов фагов светящихся вибрионов, Использование препаратов Фагов 9504 и 9510 позволяет идентифицировать нелизогенные штаммы ч.а 1 Ьепвы, что улучшает лабораторную диагностику светящихся вибрионов. 781888испытуемой культуры с индикаторнымштаммом и учетом результатов, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с це 5лью повышения достоверности способа,в качестве индикаторного штамма используют штамм 71 Ьгдо а 1 Ьепыя КМ,инкубирование проводят в течение 2024 ц, полученную смесь микроорганизмов прогревают при 55-57 С в течение40-60 мин, затем высевают ее на газон индикаторного штамма, посев повторно инкубируют и идентификациюпроводят по наличию фаголизиса.