Способ определения количества живых клеток микроорганизмов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ И СТИЧ ЕСКИХРЕСПУБЛИК п 9) ( 1) 1/04 ИЯАНИЕ ИЗОБРЕТ ВТОРСНОМ ЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЖИВЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ(57) Использование; медицина, биотехь- нология, охрана окружающей среды, 1 о- Сущность изобретения: в исследуемуюпробу, зараженную различными видами микроорганизмов, вводят одновременно два или более флуорогенных субстрата. по- Выбор субстратов зависит от числавидов микроорганизмов, присутствующих // в пробе. Измеряют суммарную величину я. флуоресценции. При этой величине определяют количество живых клеток микроорганизмов в исследуемой пробе. юл. Р 44научно-исологицеск овате прибо О.Ф.Давыд ви. пой й 1 е ась вапдяв Ьдорйу 1 п 1 егасгхо ея жди чдаЬ я ой вдсгоог а ЬдосЬыч А 7-130. Изобретение относится к областимикробиологии и может быть использовано для быстрого определения микроколицеста живых клеток в смесях, сос"тоящих из микроорганизмов различныхвидов, родов и семейств,в медицинской микробиологии, биотехнологии и охране окружающем среды.Цель изобретения - повышение чувствительности, достоверности способаи определение количества живых клетокмикроорганизмов в смесях.Способ вклюцает введение в исследуемую пробу одновременно два илиболее флуорогенных субстрата в зависимости от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе, инкубирование пробы, измерение суммарнойвеличины флуоресценции и определениепо ней количества живых клеток микроорганизмов.Смесь флуорогенных субстратов позволяет выявить живые клетки даже в ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР)(71) Всесоюзный ский институт бистроения//Асга ц.1 Ро 11 1986, И 5, р. 12 том случае, когда они не обладают фер- . ментами для расщепления какого-либо из используемых флуорогенных субстратов.П р и м е р 1. К 3 мл смеси клеток Е.со 11 Ми Ряепйнапая ацгап - Сса, приготовленной на дистиллированной воде. добавляют 0,1 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (0,1 мг/мл в этаноле) и 0,1 мл раствора 4-метилумбеллиферилбутирата (0,1 мг/мл в ,этаноле). К другим 3 мл такой же смеси клеток, предварительно прогретойодо 100 С (1 минута) и охлажденной до комнатной температуры, добавляют аналогичные количества 4-метилумбеллиферилфосфата и 4-метилумбеллиферилбутирата. Обе пробирки помещают в водяную баню при г = 40 С на 15 мин. После этого пробы быстро охлаждают дос 01-б С и флуориметрируют. Длина волны возбуждения флуоримет ра уста на вли вается на 320 нм, длина волны флуорес 177818 У1 енции 452 нм. Из величины Флуооесценции первой пробы вычитают величину флуоресценции второй пробы (Фоновой йлуоресценции 1. Полуценная величина соответствует истинному количеству живых клеток в исследуемом образце, которое находится по предварительно составленному калибровочному графику. В случае использования тольО ко 4-метилумбеллиферилфосфата опреде-, ляются только клетки Е.со 1., клетки Рзеис 1 огюпае апгапйса не определяются. В случае использования только 4-метилумбеллиферилацетата определяются только клетки Ряецс 1 овюпаз аигас- са но не Е.со 1 д. Таким образом, ис-, тинное количество живых клеток,в данной суспензии можно определить только смесью двух соответствующих Флуорогенных субстратов.П р и и е р 2. Производство кор,мового белка осуществляют на основе одного из видов рода Сап 1 Ыа. Однако в процессе Ферментации в среде обнаруживают большое колицество клеток Сапс 1 Ыа других видов, После стадии плазмолиза необходимо выявить общее количество живых клеток в продукте, .Наибольшие активности клеток рода Сап 1 Ыа - эстеразня и липазная, Они наилучшим образом выявляются с помощью 4-метилумбеллифорилацетата (4- ИУА) и 4-метилумбеллиферилбутирата (4-11 УБ).Однако они гидролизуются различны-Э 5 ми видами рода Сагсйс 1 а неодинаково, например4-11 УА 4-НУБ.Сапс 1 Ыа 1 р.1 55 70Сап 1 Ыа 1 р.2 8Сапс 1 Ыа 1 р.3 28 12СапМа 1 р,4 26 26Сапс 1 Ыа 1 р.5 21 66Следоваельно, наиболее достоверно колицестео клеток живых можно определить с помощью смеси 4-ИУА и 4-МУБ,С этой целью готовят дее пробирки плазмолизированной взвеси по 3 мл каждая. Одну из них (контрольная) прогрееают 10 мин на кипящей водяной 50 бане. Затем, к каждой добавляют по О, мл. Фосбатного буфера с рН 5,4 и по 0,1 мл 4-МУА и 4-ИУБ с концентрацией О, мг/мл этанола. Пробы инкубируютц при 37 С. Затем к каждой 55 пробирке добавляют 6 мл 1/15 молярного раствора 11 а 11 РО,с. Далее пробы центрифугируют 1 О минут при8000 об/мин. Надосадочные жидкости Флуориметрируют (% с,з = 366 нм и Э р;,ор = 452 нм) . Из величины Флуоресценции первой пробы вычитают величину Флуоресценции контрольной пробы. Полученное значение Флуоресценции соответствует количеству живых клеток в исследуемом образце. Таким образом могут быть выявлены концентрации живых клеток вплоть до 103 кл/мл.Предлагаемый способ определения живых клеток микроорганизмов отлицается высокой чувствительностью, экспресностью и достоверностью определения.Способ может найти применение для контроля качества пастерилизации, плазмолиза, стерилизации продукции или производственных емкостей в медицинской, микробиологической и пищевой промышленности, так как позволяет достоверно определять исклюцительно малые количества выживших микроорганизмов и достаточно полно определить общее количество живых клеток всех видов и родов микроорганизмов, находящихся на обрабатываемых объектах,Экспрессное, чувствительное и достоверное определение общего количества живых клеток микроорганизмов имеет большое значение для оперативного принятия соответствующих мер. Формула изобретенияРСпособ определения количества живых клеток микроорганизмов, включающий введение в исследуемую пробу флуорогенного субстрата, инкубирование смеси, измерение величины Флуоресценции и определение по ней количества живых клеток микроорганизмов, о т л и ц а ю щ и й с я тем, цто, с целью повышения чувствительности способа за счет возможности учета различных аидов микрофлоры в исследуемой пробе, е пробу вводят одновременно два или более Флуорогенных субстрата в зависимости от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе, и измеряют суммарную величину Флуоресценции.