Способ получения эритроцитарного диагностикума

союз СОЦИА ВЕтскихСТИЧЕСКИХ 19)(5)5 А 61 К 47/0 ЗОБ САНИ Т АТЕНТ ьскии институт гея крови МинистерССРановьский институт гея крови МинистерССРстваитро иммунодиальцетарного имН, 280-82,ЭРИТРОЦИТАР цина для получегностикумов раз,50,8%-ным оотношении нных эритро- СР М 715088,уро нтиным таточ,ине ранеполучения эритроцидля определения ан, включающий -ных формализироройлеров на дистилс иммуноглобулином ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(46) 07.11,92. Бюл. Кв 41 (71) Научно-исследовател матологии и переливани ства здравоохранения Уз (72) Г, Н.Хорват и А.А.Арз (73) Научно-исследовател матологии и переливани ства здравоохранения Уз (56) Регламент производ остикума на НВ анаренэр муноглобулинового су утвержден 08.04,82.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИ НОГО ДИАГНОСТИКУМА (57) Использование: мед ния эритроцитарных ди Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения эритроцитарных диагностикумов различного назначения.Известен способ получения эритроцитарного диагностикума для определения антител к австралийскому антигену в реакции пассивной гемагглютинации путем сенсибилизации отмытых эритроцитов О/1/ группы крови австралийским антигеном в присутствии хлорида хрома с последующим отмыванием сенсибилизированных эритроцитов в физиологическом растворе. при этом эритроциты сенсибилизируют антигеном в концентрации 40-60 мкГ/мл суспензии эритроцитов в присутствии 0,070,13%-ного раствора хлорида хрома и после отмывания через 3 - 6 ч сенсибилизированные личного назначения, Цель изобретения - повышение чувствительности диагностикума. Сущность изобретения: проводят сенсибилизацию формализированных отмытых эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде НВЯА 9 или антителами гепатита В в присутствии коньюгирующего агента в виде хлорида хрома, затем отмывают сенсибилизированные эритроциты физиологическим раствором, добавляют защитную среду до получения 5% взвеси эритроцитов и лиофилизуют. Сенсибилизацию проводят при 54-57 С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас.%: 0,3%-ный р-р Сц 304 0,25 - 0,35;0,2%-ный р-р К 2 СГ 207 0,15 - 0,25; 0,1%-ный р-р СгСз 0,07 - 0,15; вода дистиллированная остальное. 1 табл,эритроциты обрабатывают 0 раствором формалина при с формалина и сенсибилизирова цитов (0,24 - 0,28):1 (см. а.с. СС 1980).Достигнутый в известном способ вень чувствительности обнаружения тел у 8990% больных сыворото гепатитом не может быть признан дос ным при обследовании доноров крови удовлетворяет практическое здравоох ние,Известен способтарного диагностикуматигена гепатитасенсибилизацию 50%ванных эритроцитов блированной воде,8 Яв присутствии канъюгирующего агента в виде 0,3%-ного р-ра хлорида хрома(СгОз) при гемпературе 37.45 С в течение 30 мин с последующим отмыванием от несвязавшегося белка и хлорида хрома физиологическим раствором, добавлением защитной среды, состоящей из бычьего альбумина, буры, сахарозы и борной кислоты на дистиллированной воде, до образования 5% концентрации взвеси и, при необходимости, лиофильной сушкой (Регламент производства иммунодиагнастикума на НВз-антиген эритроцитарного иммуноглобулиновога сухого" М 280-82, утвержденного начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Минздрава СССР от 08.04.82).Известный способ выбран авторами за прототип.Имея широкое применение в отечественной медицинской поактике, известный способ не лишен недостатков, основными из которых являются следующие:- уровень чувствительности недостаточно высок (10.20 НГ) по сравнению с радиоиммунным методом, разрешающая способность которого составляет 1,5 НГ;- повышеннь;й расход дефицитного белка в связи с необходимостью использования глабулиновой фракции с титрам 1/128-1/256,Целью изобретения является повышение чувствительности диагностикума,Гоставленная цель достигается тем, чтс в известном способе получения эритроцитарного диагностикума, включающего сенсибилизацию формализованных эритрацитов в присутствии коньюгирующего агента с псследующим их отмыванием, добавление защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5% и лиофилизацию, сенсибилизацию проводят при 54 - 57 С, а в качестве коньюгирующего агента используют омесь следующего состава, мас,%:0,3%-ный р-р С 03040,2%-н ый р-р К 2 С г 2070,1%-ный р-р СгС 1 з 5 10 15 20 25 30 35 40 45- 0,250,35 - 0,15.0,250,070,15 0,47,0,75 50 Вода дистиллированная остальное Температурный интервал, использованный в заявляемом способе, отличаетсяболее высокими значениями по сравнениюс известными и активно интенсифицируетпроцесс сенсибилизации, при этом верхнее значение интервала (57 С) является предельным, так как его превышение вызываетраспад белка, В то же время использование в качестве коньюгирующега агента смеси СОЯОа, К 2 Сг 207, СгСз не только усиливаетсвязывающие (дубильные) свойства агента,но и предупреждает шлакаобразование,снижающее частоту диагностикума и, следовательно, чувствительность его как при определении антигена, так и антител,Оптимальность состава смеси:0,3%-ный р-р Си 304 0,250,350,2%-ный р-р К 2 Сг 207 0,150,250,1%-ный р-р СгСз 0,07.0,15Вода дистиллированная остальноедоказана экспериментально в процессемногочисленных исследований влияниякаждого из ингредиентов смеси в различнойконцентрации в индивидуальном и совместных влияниях на связующую способностьсуспензий эритроцитов различного происхождения и концентрации. Суммарное действие отличительных признаковпредложенного способа реализует в диагностикуме новый уровень чувствительности, сопоставимый с радиоиммуннымметодом.П р и м е р 1. К трижды отмытым в физиологическом растворе для удаления формалина 50% эритроцитам в объеме 0,5 млдобавляют восемь объемов дистиллированной воды (РН=2,0 - 2,5) и осуществляют сенсибилизацию добавлением одного объемариванольнай гаммы с титром 1/16 - 1/32 иодного объема конъюгирующего агента в виде смеси следующего состава, мас,%:0,3%-ный р-р Са 504 0,250,2%-ный р-р К 2 Сг 207 0,250,1%-ный р-р СгС 0,15Инкубацию осуществляют в термостатепри 56 С, Время сенсибилизации 25 мин,После завершения сенсибилизации полученную смесь трижды отмывают физиологическим раствором от несвязавшихсябелков и ингредиентов связующего агента,а затем добавляют известную защитнуюсреду до 5% взвеси эритроцитов и подвергают лиофильнай сушке,Полученный диагностикум используютследующим образом: готовят физиологический раствор с концентрацией эритроцитов2,5% и полученный тест доба вля ют к пробамкрови доноров в следующей последоцательности:- в лунки иммуналогического планшетавносят 25 мкл исследуемой сыворотки кровидонора, предварительно разведенной 1:8;- в лунки планшета, заполненные разведенной сывороткой, добавляют 25 мкл теста (отмытых эритрацитов);- продолжительность реакции - 25 мин,При образовании в лунках видимагаосадка в форме зонтика результат считаетсяположительным. Процент выявления Н ВзА 9 среди обследованных доноров составил 7 - 8 оь,Пороговая чувствительность диагнбстикума, откалиброванная по параллельно по ставленным опытам с использованием радиоиммунного метода составила 1,0 - 0,5 НГ антигена, Результаты апробации приведены в таблице.П р и м е р 2, К эритроцитам, приготов ленным аналогично примеру 1, добавляют очищенный НВзА 9 в концентрации 0,1-0,2 мгl мл и сенсибилизацию осуществляют при температурном режиме и в присутствии конъюгирующего агента аналогичным при веденнным в примере 1. Время сенсибилизации 30 мин. После завершения сенсибилизации эритроциты обрабатываются аналогично примеру 1. Использование полученного диагностикума аналогично 20 примеру 1.Пороговая чувствительность полученного диагностикума соответствует 0,5 - 0,25 МЕ. Частота выявления антител больных гепатитом В достигает 96 , а у обследован ных доноров 27.39 , Результаты апробации приведены в таблице.Анализ результатов, приведенных в таблице, свидетельствует о следующем;- чувствительность диагностикума, пол ученного предложенным способом, как на НВвАд, так и на антитела, соизмерима с чувствительностью радиоиммун ного метода и превышает известные в 1020 раз;- предложенный способ отличается ста бильностью и высокой степенью оптимизации параметров, - так снижение нижних пределов температурного интервала и РН раствора относительно оптимальных показателей указанных величин приводит к 40 спонтанной агглютинации, в то время как повышение верхних пределов тех же параметров относительно оптимальных показателей - к потере чувствительности, а при доведении РН раствора до 7,0 (аналогично прототипу) чувствительность диагностикума снижается до величины известного способа 1020 МЕ (строка 3.2.6 таблицы);- повышение степени выявления НВзА 9 и антител при массовых обследованиях доноров полученным в предложенном способе диагностикумом на 45 оь наиболее социально необходимо и экономически целесообразно, так как предупреждает имеющие место в медицинской практике случаи сывороточного гепатита с одной стороны, и, с другой стороны, позволяет выявить заболевание на ранней стадии его;- предложенный способ гарантирует полученному диагностикуму повышенный (в 2 раза) относительно известного срок хранения и частичную экономию дефицитного белка,Формула изобретения Способ получения эритроцитарного диагностикума, включающий сенсибилизацию формализованных эритроцитов в присутствии коньюгирующего агента с последующим их отливанием, добавлением защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5 и лиофилизацией, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительностии диагностикума, сенсибилизацию проводят при 54 - 57 С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас.ф: 0,3-ный раствор Си 304 - 0,25 - 0,35; 0,2 о-ный раствор К 2 Сг 207 - 0,15 - 0,25; 0,1 -ный раствор СгСз - 0,07 - 0,15; вода до 100,1774872 1 1 1 9 1 1 1 1 1 е 1 2а с 1 11 1 1 1 Й 1л х1 Е Хх е 1 1 1 19 леса ел хае С 1 ЕЛ о ор