Способ определения мембранотропности ксенобиотиков

(5) 5 В)ОЬЦ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯил титл4 МВДКФМ уе ъ ининге мембранот 2 АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Харьковский государственный университет им. А.М.Горького(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕМБРАНОТРОРНОСТИ КСЕНОБИОТИКОВ(57) Использование: медицина, в частностифармакология и биотехнология, и может Изобретение относится к медицине, кобласти фармакологии и биотехнологии иможет быть использовано при скринингемембранотропных препаратов, а также в исследовании молекулярных механизмовадаптации мембранной системы клетки вответ на действие разнообразных веществ,Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа оценкимембранотропности ксенобиотиков.На фиг. 1 приведены результаты активности глюкозо-фосфатазы в контроле(кривая 1) и внесении в среду препаратаамниоцен (кривая 2) при различных температурах инкубации; на фиг. 2 - кривые изменению активности глюкоэо-фосфатаэы вконтроле (кривая 3) и при внесении препарата амниоцен (кривая 4) в зависимости отвремени инкубации; на фиг. 3 - кривые изменения активности глюкозо-фосфатаэыконтрольных микросом(кривая 5) и при внесении препарата амниноцен (кривая 6). приинкубации их в 0,25 М сахарозе (а) и буферной системе (б),быть использовано в скрропных препаратов. Цель, ускорение и по вышение чувствительности способа определения мембранотропности ксенобиотиков. Сущность изобретения: определяют активность мембранного фермента, например глюкозо-б-фосфатаэы, в системе )и чего, для чего выделяют микросомы печени животных и инкубируют их в растворе на основе сахарозы при 20-26 С в течение 20- 60 мин в присутствйи испытуемого ксенобиотика. 3 ил., 2 табл,фСпособ осуществляется следующим образом.Крыс линии Вистар, самцы двухмесяч- я : ного возраста, голодающих 12 ч перед забоем, декапитируют. Печень перфузируют охлажденной до 2-4 С 0,25 М сахарозой, а после чего ее продавливают через ручной пресс или тщательно измельчают ножница- р ми. Полученный материал гомогенизиб)уют в 0,25 М охлажденной сахарозе (2-4 С) в соотношении 1 т ткани к 4 мл укаэанного Оф раствора в стеклянном гомогениэаторе с те ф флоновым пестиком 8 тракций, 1500 СЛ об/мин) при постоянном охлаждении. Гомогенат Фильтруют череа 4 Слоя марли и центрифугируют его при 1000 9 в течение 10 мин, при 2-4 С. Надосадочную жидкость центрифугируют при 11000 9 в течение 15 мин при 2-4 фС,Полученный таким образом супернатант цинтрифугируют при 105000 д в течение 60 мин при 2-4 С, Осадок микросом суспендируем в 0,25 М сахарозе, содержащей буфер или же без него (в ручномгомогениэаторе) до получения однородной суспенэии. Определяют содержание белка в суспензии и разводят суспензию тем же раствором так, чтобы в 0,1 мл суспенэии содержалось 800 мкг белка. Полученную суспензию разливают в пробирки по 1 мл и вносят по 20,50, 100 мкл раствора испытуемого препарата, Образцы инкубируют при 4,16 и 26 С в течение 20 мин или 60 м при постоянном перемешивании системы, По истечении времени инкубации в образцах определяют активность глюкоэо-б-фосфатазы одним из известных способов.Результаты влияния препарата амйиоцен на активность глюкоэо-фосфатазы в системах и чЬо и и ч 1 го приведены в табл.1,Из данных, представленных в табл. 1 следует, что в случае (0,6 мл препарата на 100 г массы тела) известного ингибируется активность фермента через 24 ч после введения животным препарата на 24, доза 0,9 мл препарата оказывает такое же действие на активность фермента. В предлагаемом способе внесение 0,05 мл преперата на 1 мг белка микросом вызывает угнетение активности фермента на 70 по сравнению с контролем уже через 20 мин. Увеличение дозы препарата в 2 раза увеличивает угнетение активности в 1,3 раза, т,е. на 90, по сравнению с контролем (табл, 2),Инкубация микросом с препаратом амниоцен в дозе 20 мкл на 0,1 мл суспензии микросом, содержащей 800 мкг белка,. при 16 ОС не вызываем статически достоверного уменьшения активности глюкоза-фосфатазы. Увеличение температуры инкубации до 19 С приводит к некоторому увеличению разницы в активности фермента между контролем и опытом по сравнению с 16 С. При температуре 20-26 С наблюдается наибольшая разница между активностью фермента контрольного и опытного варианта. Эта разница сохраняется и при 27 С, однако при этой температуре наблюдается снижение активности фермента в контрольном варианте, что может указывать на конформационные изменения мембран при этой температуре (фиг. 1).Таким образом, оптимальной температурой инкубации микросом в системе и чего при иСпытании ксенобиотиков на мем,боанотропность является температура 20- 26 оС.Что касается временных интервалов инкубации, то увеличение времени ийкубации микросом до 80 мин в среде с 0,25 М саха- розой приводит к снижению активности глюкозо-фосфатазы по сравнению с 1060-минутной инкубацией (фиг. 2). Учитывая, что исследуемый фермент является интегральным белком микросом и даже небольшие конформационные изменения мембран 5 сказываются на активности глюкозо-фосфатазы, можно полагать, что инкубация микросом при 26 С в течение 80 мин приводит к конформационным изменениям структуры микросом, которые могут приводить к поте ре биоспецифичности их взаимодействия сксенобиотиками, Подтверждением этому может служить резкое падение активностиглюкоэо-фосфатазы при 80-минутной инкубации с препаратом амниоцен (фиг. 2), С .15 этой точки зрения максимальное время инкубации не целесообразно увеличивать более 60 мин.Минимальное время инкубации определено в 20 мин потому, что при 10-15-минут 20 ных экспозициях угнетение активностифермента препаратом незначительно, а начиная с 20 мин обнаруживается достоверная разница между контролем и опытом(фиг, 2),25 Таким образом, инкубация испытуемыхпрепаратор от 20 до 60 мин в системах выделенных мембран является оптимальнойпри определении мембранотропность ксенобиотиков,30 При выборе состава среды инкубациируководствуются следующим: при суспендировании микросом в среде с буферомтрис-НС, рН 7,6, содержащем 0,05 М КС и0,005 М МдС 2 дольше сохраняется актив 35 ность фермента, что указывает на стабилизацию их структуры. Однако внесениепрепарата в систему с микросом на основесахарозы и буфера показало, что уменьшение активности глюкозо-фосфатаэы на 40 бладается в большей степени в микросомахсуспендированных в 0,25 М сахарозе (фиг.3). Очевидно стабилизация структуры мембран, вызванная составом среды инкубации,снижает чувствительность мембран к дейст 45 вию ксенобиотиков, На основании полученных результатов можно заключить, чтомикросомы суспендированныв в 0,25 М сахарозе обладают большей чувствительностью, чем в среде с буфером,50 8 предлагаемом способе о мембранотропности ксенобиотиков судят по уменьшению актйвности глюкозо-б-фосфатазы,Формул а изобретенияСпособ определения мембранотропно 55 сти ксенобиотиков путем исследования изменений в клетках печени крыс,подвергшихся воздействию ксенобиотика,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что. с цельюускорения и повышения чувствительностиспособа, в качестве биологического матери1749835 Таблица 1 Таблица 2 28 теиперат. инкубации 2 ала используют препарат микросом печени, определяют в нем активность глюкозо- фосфотазы, при этом инкубируют препарат в растворе сахарозы при 20-26 С в течение 620-60 мин и при изменении активности фермента в сравнении с контролем делают вывод о мембранотропности ксенобиотика.1749835 ЯО,Ри 2, 2 о 5 о 5 ВСоставитель И.Митюшинехред М.Моргентал Коррект Шароши М.Бланар Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 2593 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская нэб., 4/5