Способ определения сочетанной активности антибиотиков

(51)5 С 12 0 1 РЕТЕНИЯ медицинской гии и может елении чувст- тимикробным ст ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЧЕТАННОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ (57) Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано при определении чувствительности бактерий к антимикробным препаратам. Цель изобретения - повышеИзобретение относится ки ветеринарной микробиол быть использовано при опре вительности бактерий к ан препаратам. Известен способ оп ного действия двух или б на испытуемый микроб и ведений этих препарат плотных или жидких питОднако данный ме исследования чрезвычайИзвестен также спос четанного действия преп ределения сочетан-.олее антибиотиков утем серийных разов их сочетаний вательных средахтод лабораторногоно трудоемок.об определения соаратов с помощью 2ние точности и упрощение способа. На плотную питательную среду толщиной 2-2,5 мм засевают культуру микроорганизма, затем вертикально устанавливают диски с испытуемыми антибиотиками индивидуально и в виде блока из индивидуальных дисков таким образом, чтобы за каждым индивидуальным диском следовал блок, увеличивающийся на каждый последующий индивидуальный диск с антибиотиком, После инкубирования измеряют величины зон задержки роста у всех испытуемых дисков и их соединений (блоков). На основании полученных данных определяют изменение активности соединений дисков за счет каждого антибиотика. оэффициенты сочетанной активности и затем вычисляют потенциал антибиотика. Потенциал антибиотика позволяет количественно оценить активность того или иного сочетания антибиотических препаратов. 3 табл; дисков при плоском наложении их на засеянную тест-микробную плотную среду.Однако, известный способ не позволяет осуществлять количественную оценку сочетанной активности антибиотиков, так как является качественным, ориентировочным.Цель изобретения - повышение точнои и упрощение способа.Способ осуществляют следующим образом.П р и м е р 1. Использованы плотная питательная среда АГВ с толщиной слоя 2 мм и тест-микроб Ацинетобактер анитратус, суточную бульонную культуру которого в необходимой для метода дисков концентрации наносили на поверхность среды в чашке Петри и избыток отсасывали. Использованы диски с карбенициллином (К), метициллином (М) и гентамицином (Г). Укаэанные диски не накладывали на среду плоско, а устанавливали в нее вертикально на ребро до дна чашки. Сначала устанавливали диск с карбенициллином, затем на расстоянии не менее 1 см- диск с метициллином, далее (тоже с интервалом) - соединение двух дисков (плоскость к плоскости) - блок карбенициллин-метициллин (КМ), дальше на некотором расстоянии - диск с гентамицином (Г) и, наконец, блок карбенициллин-метициллин - гентамицин (КМГ). После обычной выдержки чашки при 37 С измеряли величины зон задержки роста от отдельных дисков и их соединений. При этом зоны имели овальную форму, вытянутую вдоль плоскости диска. Именно этот размер зон измеряли вдоль плоскости дисков, Полученные результаты вписывали в табл. 1, вертикальные графы которой отражали последовательность самого опыта, а горизонтальные строки - этапы математической обработки,После заполнения первой строки таблицы устанавливали вклад каждого препарата в суммарную активность сочетания, представленного соединением дисков (вторая .строка). Так, вклад карбенициллина в.активность соединения карбенициллин-метициллин равен 12 - 6 = + 6 (из общей зоны вычитали зону метициллина), а вклад метициллина равен 12 - 13 = -1.Присоединение третьего антибиотика - гентамицина - повысило суммарную активность соединения на величину 14 - 12 =+2, Но это лишь дополнительный прирост к имеющейся уже общей активности. Тогда фактическая полная величина вкладка гентамицина определится из алгебраической суммы, +6 - 1 = +7.В третьей строке записывали полную величину вклада каждого антибиотика, т.е.коэффициент его сочетанной активности:+6, -1 и+7.В последней, четвертой, строке записывали полную комплексную характеристику каждого испытанного препарата - потенциал антибиотика. Последний включал коэффициент сочетанной активности (цифра со знаком) и через запятую величину зоны индивидуальной активности. При этом зону в 6 мм (как у метициллина) считаем нулевой зоной индивидуальной активности, В итоге потенциалы карбенициллина, метициллина и гентамицина выразились соответственно тремя следующими числами: +6,13; -1,0 и +7,14.Потенциал антибиотика в данных конкретных условиях - величина постоянная и не зависит от того, в какой последовательности ведется опыт, т.е с какого антибиотика начинается и каким заканчивается, но лишь при условии максимальной стандартизации исследования. Знание потенциалов антибиотиков дает возможность сразу без дополнительного исследования количест 10 венно оценить активность того или иного сочетания препаратов. Теоретически возможны 3 варианта сочетаний;1) Целесообразные (допустимые) сочетания активных препаратов (с положительными потенциалами), здесь возможны индифферентное действие, суммация и синэргизм в зависимости от активности сочетаемых препаратов и их соотношения;2) Нецелесообразные сочетания анти 202530354050 биотиков-антагонистов (с отрицательнымипотенциалами), которые между собой даютиндифферентное действие при малой илинулевой индивидуальной активности;3) Нецелесообразные антагонистические сочетания антибиотиков с разными познаку потенциалами, в которых активные антибиотики инактивируются антибиотиками-антагонистами (не менее, чем в 2 раза).В данном конкретном случае (табл. 1) возможны 1-й и 3-й варианты.Допустимое, сочетание высокоактивных гентамицина и карбенициллина синэргизма не дает. Малое расхождение (не больше+1) или полное совпадение положительных коэффициентов сочетанной активности такихпрепаратов дает эффект суммации (при большем расхождении показателей возможно индифферентное действие - маскировка сильным антибиотиком болееслабого). Сочетание карбенициллина и гентамицина в обычных дозах дает эффект,больший одной дозы гентамицина, т.е.+7,16, но меньший двойной дозы этого препарата, т.е. +8,17 (удвоение концентрации антибиотика увеличивает на единицу его сочетанную активность и размер зоны задержки роста),Недопустимы сочетания карбенициллина или гентамицина с метициллином. Антибиотик-антагонист с коэффициентом сочетанной активности, равным -1, снижаетконцентрацию активного препарата в 2 раза и на 1 уменьшает его коэффициент сочетанной активности. Следовательно, потенциал сочетания карбенициллина с метициллином равен; +6,13 - 1,0 - +5,12; а гентамицина с метициллином +7,16 - 1,0 = +6,15.В табл. 2 приведены результаты определения активности карбенициллина, метициллина и гентамицина и их сочетанийметодом двухкратных последовательныхразведений в жидкой среде (тест-микробтот же - Ацинетобактер анитратус).Исходные концентрации антибиотиковсоответствовали их содержанию в стандартных дисках промышленного изготовления,следовательно, соотношение доз в сочета-.ниях не нарушалось.Приведенные в табл. 2 результаты подтверждают ранее сделанный вывод о целесообразности (допустимости) сочетаниягентамицина с карбенициллином и о недопустимости сочетания гентамицина с метициллином. Минимальное расхождениерезультатов в рядах объясняется грубостью 15метода двукратных последовательных разведений (ошибка метода й 50 фплюс нарастающая ошибка переноса),Проверку результатов, полученных вертикальной установкой дисков, с помощью 20плоского наложения последних на засеянную среду выполняли в 2 этапа. Сначалаопределяли величины зон задержки роста,получаемых при плоском наложении отдельных дисков этих антибиотиков. На 2;-.й 25день выполняли основной опыт, Диски сактивными. антибиотиками укладывали насреду на таком расстоянии друг от друга,чтобы их эоны только достигали (или почтидостигали) друг друга. Для проверки взаимодействия активного антибиотика с неактивным диск с последним располагали натаком расстоянии от первого, чтобы зоназадержки роста от активного препарата оказалась вблизи диска с неактивным антибиотиком,В итоге двухсуточного опыта выяснилось, что гентамицин и карбенициллин даат увеличенную, сливную зону задержки роста 40 в месте. стыковки их индивидуальных зон. Неактивный метициллин уменьшает радиус зоны активного антибиотика на прилегающей к нему стороне (сплющивает ее).П р и м е р 2. По, способу, описанному в 45 примере 1, произведено определение сочетанной активности 5 антибиотиков: левомицетина (Л),. стрептомицина (С) мономицина (М), канамицина (К) и карбенициллина (Кб) по отношению к культуре синегнойной па лочки,В табл. 3 приведены результаты опыта.В примере 2 возможны все известные варианты сочетаний, но особый интерес представляют два следующих момента; 551) Два антибиотика из одной и той же группы - мономицин и канамицин - при одинаково малой. индивидуальной активности показали противоположную активность в сочетаниях, соответственно -4 и -1. Канамицин вместе с левомицетином образует группу антибиотиков-антагонистов.2) Мономицин при минимальной индивидуальной активности (7 мм) способен повышать в 2 раза активность гораздо более активных стрептомицина и карбенициллина в сочетаниях с ними, т.е. проявляет выраженный синэргизм по отношению к ним.Таким образом, по отношению к взятою культуре .синегнойной палочки недопустимы сочетания стрептомицина и карбенициллина с левомицетином и канамицином, а целесообразны их сочетания с мономицином, так как потенциал сочетаний во втором случае возрастает благодаря: синэргизму; +3,10+ 4,7 =+4,11 (абсолютная активность удваивается), Такого же эффекта можно добиться сочетанным применением самих стрептомицина и карбенициллина в результате суммации их действия: +3,10+ 3.10 = =+ 4,11,Таким образом, способ вертикальной установки дисков в тонком слое среды(2 - 2,5 мм), засеянной тест-микробом, позволяет в одном компактном исследовании (до 8 антибиотиков на одной чашке) определить индивидуальную активность, коэффициенты сочетанной активности испытуемых антибиотиков и рассчитать степень антимикробной активности их различных сочетаний.Компактность исследования обьясняется рядом моментов. Так, размер зон задержки роста уменьшен по сравнению со способом плоского наложения дисков на величину диаметра дисков (6 мм), так как диффузия антибиотика идет со всей погруженной в среду части диска, а не с краев его, как при плоском наложении. Сложение активностей происходит не в линейном, а в логарифмическом масштабе (удвоение концентрации увеличивает зону на 1 мм). Отпадает необходимость непосредственного опробования (переборки) всех возможных сочетаний и т,д. На малой площади среды в чашке Петри получается большая и ценная информация, подлежащая дальнейшей математической обработке. Поэтому выполнять такое исследование необходимо тщательно и с максимальным обеспечением стандартности условий: состав и качество среды, толщина слоя, качество дисков и т.д. Сам способ помогает контролировать эту стандартность,Кроме того, предлагаемый способ помогает решить и еще одну важную практическую задачу - кратчайшим путем отыскать способ преодоления антибиотикорезистентности возбудителя с помощью суммарного и синэргидного действия препаратов,1730153 Табл ица 1 Определение сочетанной активности карбенициллина, метициллина и гентамицинаТаб Исходныеконцентрации вмкг/мл Антибиоти сочетани аэве ения аство ов/2 Цельное 0 МетициллинКарбенициллин ГентамицинГентамицин + карбенициллинГентамицин + м иллин 25 10 10 ети 10 аженный ост мик оба; -- отсутствие видим Примечан та; выр Р Р3 Таб яемая величин спыт емые антибиотик пред К Потен иал антибиотика 3,1 10 +4 Компактность, экономичность способа в плане материальных и трудовых затрат, быстрота выполнения (сама постановка опыта занимает несколько минут), расширенный объем получаемой информации, включающий количественную характеристику сочетаний препаратов, позволяют использовать предлагаемый способ определения сочетанной активности антибиоти ков в практической работе медицинских и ветеринарных бактериологов;Формула изобретения Способ определения сочетанной активности антибиотиков путем посева исследуемой культуры микроорганизма на плотную питательную среду, наложения дисков с испйтуемыми антибиотиками на посев, инкубирования и выявления зон задержки роста микроорганизмов,отлич а ю щи йс ятем; что, с целью повышения точности и упрощения способа, диски с испытуемыми антиби отиками располагают вертикально в слоепитательной среды толщиной 2-2,5 мм индивидуально и в виде сочетаний из двух и более дисков с разными антибиотиками, измеряют величины зон задержки роста для 10 индивидуальных дисков и их сочетаний, вычисляют величину изменения антимикробной активности сочетаний дисков за счет каждого дополнительного присоединяемого индивидуального диска и коэффициенты 15 сочетанной активности антибиотика и на основании этих поКазателей определяют сочетанную активность антибиотиков.