Способ определения функциональной активности т-лимфоцитов супрессоров

(51)5 6 01 Й 33 Т Е ИЗОБР ОПИ В соб осуществляется Предлагаеледующим об Изобретение относи ности к иммунологи ьзовано для оп редел активности Т-лимфо работки показаний к Целью изобретения времени и повышени тся к медицине, в и, и может быть исения функциональцитов-суп рессоров лечению больных. является сокращее точности опредечас по но ив Лимфоцитынте плотности0;077 г/л), дваэнкса, концен10 /мл,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТЯО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕ(71) Донецкий государственный медицинский институт им.М.Горького(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ-СУПРЕССОРОВ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности Т-супрессоров и определения показаний к лечению больных средствами иммуномодулирующего действия,-Целью изобретения является сокращение времени и повышение точности исследования. Поставленная цель достигается тем, что реакцию розеткообразования с эритроцитами барана ставят параллельно в 2 пробах с лимфоцитами, интактными и предварительно инкубированными в течение 40 - 42 мин с теофиллином. Подсчитывают розеткообразующие лимфоциты в мазках обеих проб с одновременным определениемм количества гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах, после чего вычисляют показатель функциональной активности супрессоров (СА) по формуле СА = =ДАт ДА (1-Тс)100, где ДАт - активность дегидрогеназы лимфоцитов в мазках с розеткообраэующими клетками после 40-42 мин инкубации с теофиллином; ДА - активность дегидрогеназы лимфоцитов в реакции розеткообразования беэ предварительной инкубации лимфоцитов с теофиллином; Тс - общее количество Т-супрессоров, определенное в реакции розеткообразования, При значениях показателя функциональной активности супрессоров (СА) от 0,1 до 1,1 или от 2,0 до 10,0 диагностируют соответственно снижение или повышение функциональной активности Т-лимфоцитов. Использование способа возможно в любой иммунологической лаборатории, применяющей метод розеткообразования. Способ наряду с оценкой функциональной активности позволяет количественно определить уровень Т-супрессоров в крови, укорачивает время исследования до 1 - 2 сут(по прототипу 6 - 7 сут). крови выделяют на градификолл-верографина (р = жды отмывают раствором рацию клеток доводят до45 50 55 Готовят две пробы,пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде М 199 в течение 40-42 мин при 37 С, затем отмывают забуференным физраствором,В пробирки с 0,1 мл раствора, содерЖащего лимфоциты, предварительно инкубированныеи неинкубированные (нтактные)с теофиллином, приливают 0,1 мл оаствора эритроцитов барана (5 х х 10 /мл), инкубируют в термостате при 31 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах,В этот же день мазки после их высушивания окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов. Перед гроцедурой окраски готовят раствор сукцината натрия; к 2,95 г янтарной кислоты приливают 1 мл дистиллированной воды и 2 гидроокиси натрия, после растворения готовят 0,2 М раствор в дистиллированной воде, Растворяют 0,013 г паранитротетраэоЛия фиолетового в 10,0 мл дистиллированНой воды, фильтруют. добавляют 0,015 г трилона Б, 10,0 мл фосфатного буфера (рН = =7,4) и 10,0 мл 0,1 М раствора янтарно-кислого натрия. После фиксации мазков в насыщенном растворе трилона Б в ацетоне (20 с) Дважды промывают в дистиллированной во- е и инкубируют в приготовленной среде в 1 ечение 60 мин на водяной бане при 37 С, Затем сушат и красят 1 ф -ным водным рас вором метилового зеленого (2 мин).Подсчет роэеткообраэующих лимфоцитов(окруженных тремя и более эритроцита-. ми барана) и лимфоцитов, розеток на Образующих производят путем микроскопии не менее 200 клеток в каждом мазке. Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогенаэы лимфоцигов, После этого определяют процент роэеткообразующих лимфоцитов в пробахи , вычисляют количество Т-лимфоцитов-супрессоров по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов вои пробах, а затем рассчитывают супрессорную активность Т-лимфоцитов СА по форму- ле СА = ДАт/(ДА (1-Тс/100, где ДАт - активность дегидрогеназы лимфоцитов в мазках с розеткообразующими клетками после 40 - 42 мин инкубации с теофиллином;ДА - активность дегидрогеназы лимфоцитов в реакции розеткообраэования без предварительной инкубации лимфоцитов с теофиллином; 10 15 20 25 30 35 40 Тс - количество Т-лимфоцитов-супрессоров, определенное в реакции розеткообразования,и при значениях показателя.супрессорнойактивности (СА) от 0,1 до 1,1 или от 2,0 до 10,0 диагностируют соответственно снижение или повышение функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров.П р и м е р 1, Исследуемый К., 26 лет, практически здоров. Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р = 0,077 г/л), дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 2 10 /мл. Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде М 199 в течение 40-42 мин при 37 С, затем отмывают забуференным физраствором. В пробирки с 0,1 мл раствора, содержащего лимфоциты, и редва рител ь,о ин куби ров ан ныеи неинкубированные (интактные)с теофиллином, приливают 0,1 мл раствора эритроцитов барана (5 10 /мл), инкубируют в термостате при 37 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и де- лают мазки на тщательно отмытых стеклах, После высушивания мазки окрашиваюг на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике. Подсчитывают розеткообразующие лимфоциты випробах (не менее 200 клеток в каждом мазке), Выявлено роэеткообразующих лимфоцитов впробе - 58, во- 104. Подсчет Т-супрессоров проводят по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов воипробах, т.е, (104/200) 100- (58/200)100 = 23 ( ), Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитахи .проб. Получены данные: впробе - 96, вопробе - 82. Вычисляют супрессорную активность Тлимфоцитов по формулеСА = ДАт/(ДА (1 - Тс/100) = 96/82 х х 1 - 23/100) = 1,5.Делают заключение в нормальной супрессорной активности Т-лимфоцитов, Активность супрессоров параллельно определяют в течение 7 сут, Индекс супрессии составил 36,5 , что также свидетельствует о нормальной функции Т- лимфоцитов-супрессоров. П р и м е р 2, Больная М., 46 лет. Диагноз: рак желудка, 3 стадии. Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р = 0,777 г/л),дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 2 10 /мл.6 Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде М 199 в течение 40 - 42 мин при 37 С, затем отмыва ют забуференным физраствором. В пробир; ки с 0,1 мл раствора, содержащего лимфоциты, предварительно инкубированныеи неинкубированные (интактные) ( ) с теофиллином, приливают 0,1 мл раство ра эритроцитов барана (5 10 /мл), инкуби- руют в термостате при 37 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и де лают мазки на тщательно отмытых стеклах. После высушивания мазки окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике, Производят подсчет розеткообразующих лимфоцитов в20ипробах (не менее 200 клеток в каждом мазке). Выявлено розеткообразующих лимфоцитов впробе 78, во- 110, Подсчет Т-супрессоров осуществляют по разности между процентом розеткообразующих лим фоцитов воипробах, т.е. (110/200) 100- (78/200) 100 = 16 ( ), Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитахипроб. Получены данные: впробе - 105, во30 пробе - 34, Вычисляют супрессорную активность Т-лимфоцитов по формулеСА = ДАт/(ДА (1-Тс/100 = 105/(34 х х(1-16/100 = 3,7.Делают заключение о повышенной суп рессорной активности Т-лимфоцитов, функциональная активность Т-супрессоров параллельно определяла в течение 7 сут.Индекс супрессии составил 52,6, что также свидетельствует о повышенной функции 40 Т-лимфоцитов-супрессоров.П р и м е р 3. Больная С 52 г. Диагноз: ревматизм, активная фаза, 2 степень активности, острая тромбоэмболия сосудов мозга. 45Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтЕвой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р = =0,077 г/л), дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 50 2 10 /мл. Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде М 199 в течение 40 - 42 мин при 37 С, затем отмывают забуференным физраствором. В пробирки с 0,1 мл раствора, содержащего 55 лимфоциты, предварительно инкубированныеи неинкубированные (интактные)с теофиллином, приливают 0,1 мл раствора эритроцитов барана (5 10 /мл), инкубируют в термостате при 37 С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4 С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах. После высушивания мазки окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике, Подсчитывают розеткообраэующие лимфоциты випробах (не менее 200 клеток в каждом мазке). Выявлено розеткообраэующих лимфоцитов впробе 134, во- 152. Подсчет Т-супрессоров осуществляют по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов воипробах, т.е, (152/200) 100- (134/200) 100 = 9 .Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитахипроб, Получены данные: впробе - 58, вопробе - 79, Вычисляют супрессорную активность Т- лимфоцитов по формулеСА = ДАт/(ДА (1-Тс/100 = 58/(7)хх (1 - 9/100 = 0,7Делают заключение о снижении супрессорной активности Т-лимфоцитов, что явилось показанием для назначения иммуномодуляторов, При проведении лечения тималином (иммуномодулятор) отмечено клиническое улучшение, что подтверждает результаты лечения, Функциональная активность Т-супрессоров параллельно определялась в течение 7 сут, Индекс супрессии составил 5,2 , что также свидетельствует о снижении функции Т-лимфоцитов-супрессоров,Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно сократить время, необходимое для проведения исследования (с 7 до 1 сут), При проведении исследования не требуется соблюдения стерильных условий, что значительно облегчает работу, Предложенный метод более точен и позволяет диагностировать нарушения супрессорной активности лимфоцитов в тех случаях, когда по данным других методов изменения активности Т-супрессоров не выявляются. Применение метода возможно в любой иммунологической лаборатории. При проверке предложенного метода по сравнению со способом-прототипом установлено повышение точности на 18;, что позволило повысить клиническую эффективность лечения иммуномодуляторами больных, у которых были обнаружены изменения супрессорной активности Т-лимфоцитов только при исследовании предложенным методом.1702316 Формул а изобретен ия Составитель Н.КалининРедактор А.Маковская Техред М,Моргентал Корректор О,Кундрик Заказ 4541 .Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Способ определения функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров путем постановки реакции розеткообразования с,эритроцитами барана, о т л и ч а ю)ц и й с я тем, что, с целью сокращения времени и повышения точности определения, реакцию ставят параллельно в 2-х пробах с интактными лимфоцитами и предварительно инкубированными в тече ние 40-42 мин с теофиллином, проводят подсчет розеткообразующих лимфоцитов в мазках из обеих проб с одновременным определением количества гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах, после чего 5 вычисляют соотношение активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов, инкубированных и неинкубированных с теофиллином, и при значении показателя соотношения 0,1- 1,1 определяют снижение супрессорной ак тивности Т-лимфоцитов, а при значении2,0-10,0 определяют повышение супрессорной активности Т-лимфоцитов.