Способ определения пестицидной интоксикации рыб

(51)5 6 0 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Изоб кологии и агности загрязне цидами. 00 овышение точноЦель изобр сти определени На чертеж кривая, поясня Способ осуетени изображена кинетическаящая способ.ествляют следующим обрао пытную и контрольартию помещают в Рыб разделяют н ую партии, опытнуюГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства(56) Зигова И.Л. и др. Мембранотоксический эффект воздействия пестицидов на промысловую ихтиофауну. - Тезисы докл. к ХХЧП съезду Госхимкомиссии Итоги госиспытаний пестицидов, биопрепаратов и регуляторов роста растений в 1986 г. М., 1987, с. 229 и 230.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕСТИЦИДНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ РЫБ(57) Изобретение относится к водной токсикологии и может быть использовано для диагностики интоксикации рыб. Целью тение относится к водной токсиожет быть использовано для дии интоксикации рыб при и рыбоводных водоемов пестиизобретения является повышение точности определения. Рыб разделяют на опытную и контрольную партии. Опытную партию помещают в исследуемую среду. Затем отбирают пробы крови у рыб обеих партий, проводят отмывку эритроцитов в забуферной изотонической среде и гемолиз эритроцитов путем смешивания отмытых эритроцитов с буфером и последующим центрифугированием. Определяют концентрацию гемоглобина и выравнивают ее во всех пробах, далее устанавливают в них значение рН, равное физиологическому рН крови рыб. После обработки проб нитритом натрия ежесекундно регистрируют экстинкцию гемоглобина, а пестицидную интоксикацию у рыб устанавливают при отклонении времени полуокисления гемоглобина в опыте по сравнению с контролем более чем на 30 6. 3 табл. исследуемую среду, затем отбирают пробы крови у рыб обеих партий, проводят отмывку эритроцитов в забуферной изотонической среде и гемолиз эритроцитов путем смешивания отмытых эритроцитов с буфером и последующим центрифугированием, определяют концентрацию гемоглобина и выравнивают ее во всех пробах, далее устанавливают в них значение рН. равное физиологическому рН крови рыб, после обработки проб нитритом натрия ежесекундно регистрируют экстинкцию гемоглобина, а пестицидную интоксикацию у рыб устанавливают при отклонении времени полу 16935485 10 15 20 25 30 35 40 50 55 окисления гемоглобина в опыте по сравнению с контролем более чем на 30.П р и м е р 1. Для эксперимента брали лещей 2-летнего возраста, выдержанных 4- 5 сут в аэрированной водопроводной воде, Их помещали в емкости с водой, содержащей хлорорганический пестицид полихлор, пинен (ПХП) в концентрации 0,5 мг/л. В , контроле рыбы содержались в аэрируемой , водопроводной воде без токсиканта. Эритроциты отмывали в 130 мМ раствора йаС эабуференным 20 мМ трис-буфером рН 7,4 и гемолизировали 10 мМ трис-буфером рН 7,4. Концентрацию гемоглобина выравнивали во всех гемолизатах, доводя Е 576 до 0,5001+ 0,010 путем разбавления гемолизата 10 мМ трис-буфером рН 7,4.Для контроля выравнивания снимали спектры поглощения гемолизатов в диапазоне длин волн 500-600 нм на спектрофотометре. К 3 мл гемолизата в кювете спектрофотометра добавляли 50 мкл 35 мМ раствора нитрита натрия 10 мМ трис-НС буфера рН 7,4. Кинетику реакции окисления НЬ 02,нитритом натрия регистрировали при А=630 нм, температуре 25 С, рН 7,4. Оптимальная концентрация нитрита натрия для гемоглобина леща составляла 10 мМ. Изменение экстинкции гемоглобина регистрировали в течение 500 с со скоростью 60 измерений в 1 мин. По кинетической кривой определяли время, за которое экстинкция гемоглобина достигала величины, равной половине максимальной, время полуокисления гемоглобина то,5 выражали в секундах, Полученные данные приведены в табл.1.Как видно из табл,1, воздействие ПХП на лещей в течение 24 ч достоверно снижает время полуокисления гемоглобина (1 о,5) на 42,8 (Р 0,02). При 48-часовой экспозиции ПХП отмечается достоверное снижение то,5 0,05).П р и м е р 2, Аналогично примеру 1 исследовали действие ГХЦГ (гексахлорциклогексана) на кинетику полуокисления гемоглобина леща нитритом натрия. Концентрация ГХЦГ составляла 2 мг/л,Результаты исследования представлены в табл.2,Как видно изтабл.2, под влиянием ГХЦГ достоверно снижается время полуокисления гемоглобина лещей на 36 О/.. П р и м е р 3. Аналогично примеру 1 определяли кинетику окисления гемоглобина лещей нитритом натрия под воздействием растворенных в воде фосфорорганических пестицидов паратион-метила и базудина в концентрации 5 мг/л и 0,1 мг/л соответственно,Результаты исследований представлены в табл.З.Как видно из табл.З, воздействие на лещей паратион-метила в течение 24 ч, увеличивает то,5 на 107,9%, а через 48 ч - на 43,5, базудина на 127,8 и 42,6 соответственно,Полученные данные свидетельствуют о существенных нарушениях функционального состояния гемоглобина при пестицидной интоксикации.Сравнение результатов регистрации кинетики полуокисления гемоглобина под воздействием хлор- и фосфорорганических пестицидов показыает, что хлорорганическая интоксикация сопровождается снижением времени полуокисления, а воздействие фосфорорганических - противоположным изменением функционального состояния гемоглобина.Минимальное отклонение от контроля в приведенных примерах составляло 30,5. Таким образом, изменение кинетики полу- окисления гемоглобина рыб более чем на 30; по сравнению с контролем свидетельствует о патологии и может быть принято за показатель пестицидной интоксикации рыб.Предлагаемый способ позволяет улучшить качество исследований пестицидной интоксикации рыб за счет повышения точности и достоверности ее определения. Формула изобретения Способ определения пестицидной интоксикации рыб, предусматривающий разделение рыб иа опытную и контрольную партии, помещение опытной партии рыб в исследуемую среду, отбор проб крови у рыб обеих партий, отмывку и гемолиз эритроцитов, определение концентрации гемоглобина, .обработку нитритом натрия,установление времени полуокисления гемоглобина путем регистрации динамики экстинкции раствора, сравнение опытных и контрольных данных и установление пестицидной интоксикации у рыб опытной партии в случае отклонения опытных данных от контрольных, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, отмывку эритроцитов проводят в забуференной изотонической среде, а гемолиз - путем смешивания отмытых эритроцитов с буфером с последующим центрифугированием, после определения концентрации гемоглобина осуществляют выравнивание экстинкции растворов и установление в них значения рН, равного физиологическому рН крови рыб, во всех пробах, после обработки нитритом натрия экстинкцию гемоглобина регистрируют эжесекундно, а пестицидную1693518 окисления гемоглобина в опыте по сравнению с контролем более чем на ЗО.,интоксикацию у рыб опытной партии устанавливают при отклонении времени полуТаблица Показатели Контроль Время окисления с,при экспозиции24 ч 48 ч 422,8 255,7 194,8 182,4 181, 5 255,4 322,1 478,2 286,439,8 Х+ВРПроцент Табли ца 2 Показатель Время окисления с 46 при156 ч Контроль Кинетика нитритного окисления гемоглобина Х+8 Р.Процент Таблица 3 брют лол)численияэ с Показатели Парагинон-кетил КонтКонтроль роль 247,4 225,4 224,8 255,7 319 е 6 275,0 332,0 17110691 46 74 32 227, 334,5 277,1 466,3 450,3 554,9 463,6 291,0 404,5 548,8 845,7 05325 Кинетика ннтритного окисления геногло- бина 7837 29 215 3570 8 В 39 27 28 81 45гог28 363+40,921 ю 1срз 05+07,В 611,7 с 0,0127 э 68,97С 0,05 +43,5 Кинетика нитритного окисления гемоглобина 108,0 117,2 204,2 135,5 152,0 149,1 206 3 238,0 163, ,Ф 1615 (0,02 -42,8 143 235 314 241 401 267+43 193,9 -261, 6221, 7 183,7 148,4 221,8 224,0207,9+13 7 с 0,05 -30,5 183 210 141 171 159 1 7(й 10 (0051693548Составитель О.Корженко Редактор М.Бланар Техред М.Моргентал Корректор Т.Палий аказ 4078 Тираж Подписное ВНИИПИ Государст венного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5