Способ определения адреналина в биологическом материале

(505 6 01 й 33/84 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2 носится к области фиэидов анализа, в частноическому определению реналина в биологичегих растворах, и может в медицине и фармакоИзобретение от ко-химических мет сти к потенциомет микроколичеств адских средах и в др быть использовано логии,( (х+2 а ) - 1 - 2 а( 1 х 1 х(1 х а 1) (х повышение чувсте способа.тся следующим обде 1(х) - количество еском материале,мтх - время падени рН в пробе без добаа - фиксированн адреналина в биологиоль/л,я потенциала на 0,3 ед. вки адреналина, с; ое количество адренаму катализатору с МАО) активностью рови, боратный буебротонина в конеч10 М, через условиях термостакислород, затем поделяют выделение лина;тх+а -ед. рН вплина, с; мя падения ие с добавкой нциала на оль/л ядре ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Латвийский государственный университет им. П,Стучки(56) Авторское свидетельство СССРМ 1562858, 30.01.89,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(57) Изобретение относится к физико-химическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению Цель изобретения -вительности и ускорени Способ осуществляе разом,К биоспецифическо моноаминоксидазной ( добавляет сыворотку к фер, рН 7.6, и раствор с ной концентрации 5 10 измерительный сосуд в тирования пропускают тенциометрически апремикроколичеств адреналина в биологических средах. Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа. Способ заключается в том, что в исходную пробу добавляют серотонин в конечной концентрации 510 - 5 10 М, деэаминируют при помощи биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и измеряют скорость дезаминирования серо- тонина в присутствии добавок адреналина. По скорости дезаминирования расчетным путем определяют концентрацию адреналина в исходной пробе. Изобретение позволяет в течение 40 - 60 мин провести определение адреналина в биопробе, минимальное определяемое количество адреналина 210 моль/л. 1 табл,аминопроизводных, фиксируя время падения потенциала на 0,3 ед. рН, Расчет количества адреналина проводят по формулетх+2 а - ВрЕМя ПадЕНИя ПОтЕНцИаЛа На 0,3ед. рН в пробе с добавкой 2 а мольл адреналина, с.П р и м е р 1, Определение сыворотки вкро.ви.Проба 1-я, 0,5 г биоспецифического катализатора с моноаминоксидаэной (МАО)активностью помещают между мембранамиячейки и промывают 0,01 М боратным буфером (РН 7,6) и бидистиллированной водой.Ячейку помещают в сосуд для измеренийэлектрода с газовым зазором, добавляюттуда же анализируемую пробу - 1 мл сыворотки крови и 2 мл 0,1 М боратного буфера(РН 9,0), Измерительный сосуд закрывают,помещают в термостат при 45 С, включаютмагнитную мешалку и 10 мин пропускают 02без С 02, Далее поток 02 перекрывают, уобавляют в реакционную среду 1 мл 1 10 Мраствора серотонина (концентрация в пробе 2;5 10 М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют времяпадения потенциала на 0,3 ед, РН (1 х = 380с).Продолжительность анализа 20 мин.Проба 2-я, Анализируемую пробу подготавливают следующим образом,0,5 г биоспецифического катализатора сМАО активностью, подготовленную аналогично пробе 1-й, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором,добавляют туда же анализируемую пробу -1 мл сыворотки крови, 1,8 мл 0,1 М боратного буфера (РН 9,0) и 0,2 мл 1 10 М раствораадреналина(стандартная добавка а =510 М).Далее выполняют все операции аналогичнопробе 1-й.Время падения потенциала на 0,3 ед.РН 496 с (тх+а =. 496 с),Продолжительность анализа 22 мин.Проба З-я, Выполняется аналогичнопробе 2, но стандартная добавка адреналина - 0 2 мл 2 10 М раствора адреналина(110 М в пробе). Время падения потенциала на 0,3 ед. РН равно 571 с(тх+2 а = 571 с),Продолжительность анализа 26 мин.Из данных, получаемых при анализепроб 1-, 2- и З-й, определяют концентрациюадреналина; тх = 380(найдено в пробе 1)1 х+а 496 (найдено в пробе 2)1 х+2 а " 571(НайдЕНО В ПрабЕ 3)а " 5 10 М (добавлено адреналина впробе 2)2 а = 110 М (добавлено адреналина впробе 3)Согласно формулам 1 х + а 1 х 1 х+2 а5 Ь 2 хнаходят496Ь 1- 380-1-0,3,10571Ь 2= 380 -1=0,5Согласно формуле 3(х) =аЬ 2 - 2 аЬ 15 10 05 - 1 10 030,3 - 0,5находят концентрацию адреналина в сыворотке крови:12 = 2,5-10 М .П р и м е р 2, Определение адреналинав экстракте сердца морской свинки.Проба 1-я. 0,06 г препарата с МАО активностью (2), помещают между мембранами ячейки и промывают 0,01 М фосфатным буфером (РН 7,6) и бидистиллированной водой, Ячейку помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют туда же анализируемую пробу - 1 мл экстракта сердца морской свинки, Добавляют 2 мл 0,1 М боратного буфера (РН 9,0). Измерительный сосуд закрывают, помещают в термастат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 02 без С 02, Далее поток перекрывают, добавляют в реакционную среду 1 мл 2 10 М раствора серотонина (концентрация в пробе 510 М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 0,3 ед. РН (тх = 760 с),Продолжительность анализа 29 мин, Проба 2-я. Анализируемую пробу подготавливают следующим образом,0,06 г препарата с МАО активностьюпомещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют анализируемую пробу - 1 мл экстракта сердца морской свинки, 1,8 мл 0,1 М боратного буфера (РН 9,0) и 0,2 мл 4 10 М раствора адреналина (стандартная добавка а = 210 ). Далее выполняют все операции аналогично пробе 1-й.Время падения потенциала на 0,3 ед.РН тх+а = 1400 с.Продолжительность анализа 37 мин,=25 10 М15 В таблице представлены данные определения содержания адреналина в различных биологических материалахпредложенным и известным способами.Продолжительность определения предложенным способом 40-6 О мин,Продолжительность определения поспособу-прототипу 2,5 - 3 ч (продолжительность инкубэции, полное дезаминирование,25 установление постоянного потенциала).Приведенные примеры показывают хорошее совпадение результатов, полученныхпредложенным и известным способам, Вслучае концентраций ниже 5 10 М известным способом адреналин не определяется,поскольку чувствительность метода недостаточна,Чувствительность предложенного способа повышается на три порядка, минимальная определяемая концентрация 2 10-9моль/л,=4 10 мортир ф ормула изобретения.Способ определения адреналина в био логическом материале путем дезаминирования моноамина при помощи биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и последующей потенциометрической регистрации 45 аминопроизводных, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в исследуемые пробы дополнительно вводбят серотонин и .концентрации 5 10 -5 ф 10 М, регистриру ют выделение аммиака в пробах, содержащих биологический материал, и фиксированное количество адреналина, а расчет проводят по формуле 551 х+га в( х+гах 1 ) ( фх 2 а1 х Проба 3-я. Выполняется аналогично пробе 2, но станэртнэя добавка адреналина - 0,2 мл 8.10 раствора адреналина; 2 а= = 410 М 1 х+га = 1932 С.Продолжительность анализа 45 мин. Из данных, полученных при анализепроб 1-, 2- и З-й, определяют содержаниеадреналина: а=2 10 М; 2 а= 4 10 М;2 10 1,54 - 4 10 0,840,84 - 1,54 П р и м е р 3, Определение адреналйнав крови,Проба 1-я. 0,5 г препарата с МАО активностью (1) подготавливают аналогично пробе 1-й примера 1. В сосуд для измеренийэлектрода с газовым зазором добавляютанализируемую пробу - 1 мл крови, туда жедобавляют 2 мл 0,1 М боратного буфера (рН9,0); Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45 С, включаютмагнитную мешалку и 10 мин пропускают 02без С 02. Далее поток 02 перекрывают, добавляют в реакционную сферу 1 мл 2 10 Мсеротонина (концентрация в пробе 5 10М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 03 ед. рН тх= 360 с.Продолжительность анализа 18 мин.Проба 2-я, Выполняется аналогичнопробе 1-й, В сосуд для измерения добавляют 1 мл крови. 18 мл 0,1 М боратного буфера- 5 ф 10 М), Далее все выполняют аналогично пробе 1-й.Время падения потенциала на О,З ед.рН равно=470 с,Продолжительность анализа 23 мин,Проба 3-я. Выполняется аналогичнопробе 2, но стандартная добавка адреналина - 0,2 мл 210 М раствора адреналина;2 а = 110 М тх+га = 543 С.-5Продолжительность анализа 25 мин,Из данных, полученных при анализепроб 1-, 2- и З-й, определяют содержаниеадреналина: Сх+а = 470 С тх+га = 543 С; 470 , 543Ь 1 = 360 - 1 =0,3; Ь 2 = 360 - 1 =0,5; 5: 10 ф 05 - 1 10 03(х) 03 051 Г 112 Щ где 1(х) - количество адреналина в биологи. ческом материале, моль/л;тх - время падения потенциала на 0.3 ед, рН в пробе без добавки адреналина, с;а - фиксированное количество адренапина; 1 х 1 а " ВрЕМя ПадЕНИя ПОтЕНцИаЛа НЭ 0,3ед, рН в пробе с добавкой а моль/л адреналина, с;1 х+2 - время падения потенциала на 0,3 5 ед. рН в пробе с добавкой 2 а моль/л адреналина, с,Известный способ Содержаниеадреналина,моль/л Предлагаемый способ Биологический материал,5. 10 2,0 2,5 Экстракт мышцы Сыво отка к ови 2 осгавигель Н. Г у 11 яе 11,1ехрвд М.ЗЛорген 1;1 л Кх 1 рргктор С. Шевкун Редактор Л, Весвлпвскв аказ 3310 ТиГ 1 аж 390 ВНИИГ 1 И Госуд рс 1 вс:н 1 Г 1 го ксмюегв по 1 11".1.05, Москва, К.Л 5