Способ дифференциальной диагностики идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и гипопластической анемии

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ 164 РЕСПУБЛИ 19(я)5 0 01 М 33/5 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ РЕНЦИАЛЬНОИ ДИАТИЧЕСКОЙ ТРОМКОЙ ПУРПУРЫ И Й АНЕМИИ осится к медицине и ано при дифференцизаболеваний крови, х форм, Цель - повы(54) СПОСОБ ДИФФЕ АГНОСТИКИ ИДИОП БОЦИТОПЕНИЧЕС ГИПОПЛАСТИЧЕСКО (57) Изобретение отн может быть использов алькой диагностике особенно из атипичнь Тщательн тельна, так ка данной патол жатся фактор следования и В роли таков ланаправле догенные ток друют с арным цифисибиГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения УЗССР(56) Руководство по гематологии./ Под, рА.И,Воробьева.М 1985, т.2, с. 138 - 195 Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано при диагностике заболеваний крови,Целью изобретения является повышение точности способа.Цель достигается тем, что из крови больного выделя 1 от лимфоциты, отмывают от плазменных факторов, первую порцию лимфоцитов инкубируют с тромбоцитарным антигеном, затем их отмывают ат несвязанного антигена и повторно инкубируют с второй порцией отмытых лимфоцитов, и при количестве лимфоцитарных агглютинатов2,5 диагностируют ИТП, а при результате2,50 ь диагностируют ГА.Сущность. способа заключается в том, что производят исследование крови больношение точности диагностики. Иммунологический способ основан на специфической реакции взаимодействия сенсибилизированных антигенсвязывающих лимфоцитов больного с тромбоцитарным антигеном, включающий выделение из крови больного лимфоцитов, их отмывку от плазменных факторов, инкубацию первой порции лимфоцитов с тромбоцитарным антигеном, отмывку лимфоцитов от несвязанного антигена и последующую инкубацию с второй порцией отмытых лимфоцитов. При количестве лимфоцитарных агглютинатов, равном и более 2,5 относительно контроля, диагностируют идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), а при результате менее 2,50 - гипопластическую анемию (ГА), При атипичных формах ИТП и ГА точность диагностики повышается до 89 - 93%. го, при этом: из крови выделяют лимфоцилимфоциты отмывают от плазмы,ая отмывка от плазмы обязак нами было выявлено, что при огии в плазме больного содеры, искажающие результаты исснижающие точность способа. ых могут выступать аутоантитенные против тест-антигена, энсины, блокирующие факторы и Полученные лимфоциты инкуби аранее приготовленным тромбоцит нтигеном. На этом этапе антиген сп ески связывается с мембранами се изированных лимфоцитов, 1647404Лимфоциты отмывают от несвязанногоантигена, чтобы исключить его участие вдальнейшем процессе.Полученные лимфоциты повторно инкубируют с новой порцией отмытых от плазмы лимфоцитов того же больного. При этомсенсибилиэированные лимфоциты новойпорции через антигенный мостик связываются с ранее инкубированными лимфоцитами, образуя агглютинаты.Результат исследуют под микроскопом,подсчитывая процентное отношение агглютинатов к свободно лежащим лимфоцитам.При количестве лимфоцитарных агглютинатов равном и более 2,5 ставится диагнозИТП, а при результате менее 2,5;4 диагностируют ГА.Приготовление антигена иэ тромбоцитов человека,Берут из локтевой вены 10 - 12 мл донорской крови.на гепариновый раствор (по25 ед.гепарина на 1 мл крови). Центрифугированием (10 мин при 1500 об/мин) осаждают лейкоциты и эритроциты. Надосад. нуюжидкость, .которая содержит тромбоциты,пере осят в другую силиконированную пробирку и отмывают физиологическим раствором (0,85 ф(,) три раза с помощьюцентрифугирования (при 3000 об/мин, 20мин). Затем подсчитывают число тромбоцитов общепринятым способом, делают мазокиэ осадка тромбоцитов, высушивают его;окрашивают по Романовскому-Гимзе и микроскопируют (90 х 10) общепринятым способом. При этом определяют в нем наличиетромбоцитов.8 отдельных случаях в мазке обнаруживаются не только тромбоциты, но и эритроциты и лейкоциты донора, В этих случаяхпроводят дополнительную очистку тромбоцптов. Для этого осадок ресуспендируют вфизиологическом растворе и центрифугируют в пробирке (при 1000 об/мин, 5 мин),Затем надосадок, содержащий тромбоциты,переносят в другую пробирку и вновь центрифугируют (при 3000 об/мин, 20 мин),Надосадок удаляют, а осадок, состоящий изтромбоцитов, разводят в 2 мл физиологического раствора и разрушают при помощи последовательного замораживания вморозильнике бытового холодильника иразмораживания с подогревом до 40 С втеплой воде 3-4 раза,После этого концентрацию белка в антигоне иэ тромбоцитов доводят до рабочейконцентрации 280 мкг/мл. Антиген разливаот по 0,5 мл в стерильные ампулы, ихзапаивают, эамораживают и сохраняют вморозильнике бытового холодильника при4 С, Антиген, приготовленный указаннымспособом, пригоден в течение 2 - 2,5 мес, Работа ведется в асептических условиях.Выделение лимфоцитов проводят общепринятым способом 2 мл крови больного, взятой на гепариновый раствор (25 ед.гепарина на 1 мл крови), разводят в соотношении 1;2 средой 199. Осторожно наносят кровь на раствор фиколла (3 мл) с плотностью 1,077 г - мл в центрифужную пробирку и центрифугируют при 1500 об/слин 30 мин. После центрифугирования клетки 510 крови разделяются на две фракции; белый слой, состоящий из лимфоцитов, располагается на поверхности фиколла, а эритроциты 15 и гранулоциты - на дне пробирки.Лимфоциты собирают пастеровской пипеткой в коническую пробирку и отмывают три раза средой 199 с центрифугированием 20 25 встряхивают и инкубируют 30 мин при 37 С. После инкубации проводят отмывку лимфоцитов от лишнего несвязанного антигена в среде 199 путем центрифугирования в течение 5 мин при 800 об/мин.К отмытым от антигена клеткам добавляют вторую порцию лимфоцитов (0,1 мл), смесь встряхивают, центрифугируют 5 мин при 800 об/мин, Инкубируют 30 мин при 37 С, В контрольную пробу вместо антигена добавляют равное количество среды 199, Из 30 35 осадка готовят мазки, которые быстро высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимэе, Мазки микроскопируют, подсчитывая в них 200 лимфоцитов, отмечая среди них агглютинаты, состоящие иэ 2-3 лимфоцитов, которые представляют собой антигенсвяэывающие клетки, Число агглютинированных лимфоцитов выражают в о/ к общему числу подсчитанных лимфоцитов, Результат выражают разностью лежду опытной и контрольной пробами.П р и м е р 1, Приводят примеры клинического применения способа. Типичная форма ИТП. Больная Л., 23 г. поступила в клинику с жалобами на кровоподтеки под кожу конечностей, десневое кровотечение. Направительный диагноз; ИТП. Болеет в течение 3 лет, неоднократно лечилась гемостатическими препаратами и кортикостероидами, но кровь и ее компоненты не переливались. Анализ крови; НВг/л, эритроциты 4,85 10 кл/л, лейкоциты12 4550 55 при 800 об/мин 5 мин. Подсчет лимфоцитов проводят в камере Горяева общепринятым способом и доводят их концентрацию до 2 10 клеток в 1 мл.Регистрация антигенсвязывающих лимфоцитов в крови больных.В опытной пробе к 0,1 мл лимфоцитов добавляют 0,1 мл антигена иэ тромбоцитов, 1 б 474046,5 10 кл/л, лимфоциты 20 , тромбоциты 4,3 10 кл/л, При исследовании костного9мозга последний богат клеточными элементами, лимфоцитов 5,2 , множество мегакариоцитов (в.двух препаратах подсчитано 20 мегакариоцитов, из них 12 не функционирует, 8 функционирует слабо), Содержание антигенсвязывающих лимфоцитов составило б , чем подтвержден направительный диагноз: ИТП. Проведено консервативное лечение с последующей операцией - спленэктомией, Состояние больной быстро улучшилось (кровоподтеки полность 1 о рассосались, увеличилось количество тромбоцитов - 466,0 10 кл/л, лейкоцитов 12,3 10 кл/л.П р и м е р 2, Атипич.ная форма ИТП. Больная К., 14 лет, госпитализирована с направительным диагнозом: ГА. Жалобы при поступлении на носовое, маточное и десневое кровотечение. В течение двух лет безуспешно лечилась трансфузиями крови и ее компонентами. Объективно: состояние больной при поступлении тяжелое, кожные покровы бледны, множественные кровоподтеки по всему телу разного размера и давности, регионарные лимфоузлы не увеличены. Пульс слабого наполнения и напряжения, учащен до 108 уд/мин, артериальное давление 100/60 мм рт.ст. Анализ крови гемоглобин 40 г/л, эритроциты 2,0 10 кл/л,12 тромбоциты 16,0 10 кл/л, лейкоциты93,7 10 кл/л, лимфоциты 45%, На основании клиника - гематологических данных больной был поставлен предварительный диагноз: гипопластическая анемия. Но, поскольку количество антигенсвяэывающих лимфоцитов, определенное предлагаемым способом, составило 7 , был поставлен другой диагноз: хроническая рецидивирующая форма идиопатической трамбоцитопенической пурпуры, осложнение - постгеморрагическая анемия,Было назначено соответствующее лечение, состояние улучшилось, кровоподтеки рассосались, увеличилось количество гемоглобина до 100 г/л, эритроцитов до 3,5 10 кл/л, лейкоцитов до 7,8 10 кл/л, снизилось содержание лимфоцитов до 31%, увеличилась количество тромбоцитов 38,610 кл/л. Последующее наблюдение и данные миелограммы подтвердили правильность нашего диагноза. Миелограмма: костный мозг многоклетачен, красный растак раздражен, лимфоциты 17%, множество мегакариацитав (из 14 подсчитанных функционируют 2). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 П р и м е р 3. Типичная форма ГА, Больной М., 10 лет поступил в клинику с жалобами на слабость, носовое кровотечение, множественные кровоподтеки, шум в ушах и затемнение перед глазами, Направиельный диагноз; ГА. В течение года многократно лечился в различных лечебных учреждениях с малым клиническим эффектом, Объективно: состояние больного тяжелое, кожные покровы бледные, множественные кровоподтеки, носовое и десневое кровотечения. Анализ крови: гемоглобин 60 г/л, эритроциты 1,8 10 кл/л,12 Р лейкоциты 1,15 10 кп/л, лимфоциты 75 о ,9тромбоциты 2,24 10 кл/л. Миелограмма:9костный мозг малоклеточен, повышено содержание лимфоцитов 4 Х 8%. Б двух препаратах костного мозга найден всего один мегакариоцит,и тот не функционирует. Содержание антигенсвязывающих лимфоцитав по предлагаемому способу 1,5 , что подтверждает направительный диагноэ - гипопластическая анемия,После проведения целенаправленного консервативного лечения многократным переливанием крови стойкого улучшения клиника-гематологических показателей не наступило (кровоподтеки не рассосались, осталось сниженным содержание гемоглобина 70 г/л, эаитроцитов 2,0 10 кл/л, а лимфоцитов повышенным 63%), Учитывая малоэффективность консервативного лечения. больному проведено опера 1 ивное лечение - пересадка аллогенного костного мозга от родственника, после чего наступило улучшение,П р и м е р 4. Атипичная форма ГА, Больной Р., 13 лет, поступил в клинику с направительным диагнозом; ИТП. Жалобы при поступлении на носовое кровотечение и кровоподтеки, общу 1 о слабость, Обьективно: состояние средней тяжести, кровоподтеки под кожу нижних конечностей и предплечий, незначительное носовое кровотечение. Анализ крови: гемоглобин 82 г/л, зриг 9 аоциты 3,1 10 кл/л, лейкоциты 4,310 кл/л, лимфоциты 32 , тромбоциты 34,6 10 кл/л, Содержан 1 е антигенсвяэы 9вающих лимфоцитов 1 о , на основании чего диагноз ИТП изменен на ГА, После адекватной терапии исследована миелограмма; костный мозг умеренно клеточен, повышено содержание лимфоцитав 39 о , мегакариоцитов мало, (в двух препаратах найдено всего 4 мегакариоцита, из них функционирует только один), Анализ крови после лечения: гемоглобин 95 г/л, эритроциты 3,5 10 кл/л, лейкоциты 3,7 10 кл/л, лимфоциты бб,4, таомбоциты 92,3 10 кл/л, Наступило1647404 вследствие перечисленного становитсявозможной экономия затрат на диагностикуи лечение больных ИТП и ГА,Формула. изобретения10 Составитель П,БонарцевТехред М,Моргентал Корректор А,Осауленко Редактор А,Шандор Заказ 1395 Тираж 418 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 клиническое состояние и в дальнейшем было произведено оперативное лачение - сплензктомия.П р и м е р 5. Здоровый донор костного мозга И 27 лет, ближайшее время ничем не болел. Анализ крови; гемоглобин 134 г/л, эритроциты 4,3 10 кл/л, лейкоциты97,6 10 кл/л, лимфоциты 24, тромбоциты 286,0 10 кл/л. Миелограмма; костный9мозг богат ядросодержащими элементами, лимфоцитов 14,8;, мегакариоцитов много (в двух препаратах 14 мегакариоцитов, иэ них 12 функционирукццие), Антигенсвязывающих лимфоцитов по предлагаемому способу 1,2.Выполнение дифференциальной диагностики ИТП и ГА предлагаемым способом, по сравнению с известными, обеспечивает:ускорение диагностического исследования в 2-3 раза по сравнению с прототипом (2,5-3 ч против 6 - 8 ч);дифференциальную диагностику ИТП и ГА по анализу крови;снижение травматичности исследования,по сравнению со способами диагностики по костному мозгу; .повышение точности диагностики ИТП . и ГА и особенно их атипичных форм;сокращение объема крови и ее компонентов, затрачиваемых на безрезультатное лечение при ошибочном диагнозе; 5 При атипичных формах ИТП и ГА точность диагностики повышается до 89- 93. Способ дифференциальной диагностики идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и гипопластической анемии путем исследования клеток крови, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышенияточности способа, из крови выделяют лимфоциты, часть из которых инкубируют с тромбоцитарным антигеном с конечной концентрацией белка 140 мкг/мл в течение 20 30 мин при 37 С, отмывают и соединяют сравным объемом другой части нативных лимфоцитов, далее готовят мазки, окрашивают их, подсчитывают процентное содержание агглютинированных лимфоцитов, 25 сравнивают с контролем, не содержащимтромбоцитарного антигена, определяют разность показателей и при ее величине, равной и более 2,5 О, диагностируют идиопатическую тромбоцитопеническую 30 пурпуру, а при величине менее 2,56 диагностируют гипопластическую анемию.