Способ получения инсулина человека

Прои 1 з обре ие относится иотехн е-ИН 3н че -логии и мож шс - тре - т олучени инс овека, инк ксипсппдаз ри рН 7,5- роизвоцньп гнами т. Ре щепи спо- ения реошш стр варительнои тия за хими ч е с ких щение вре окраСпособ одрожжевой кращать инсувека в резаланина, на на т одно реонин ои ии)инкуба дну стадию бе очного продук б осуществляе выделени ромежу оя следующим по образом ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР м Клаус, 1.хансен Джек) и Видмер Фред (СН)8 (088.8) ет быть использованоинсулина человека из лина свиньи.Цель изобретения - уг соба, достигаемое за сче трудоемких операций пред обработки инсулина и сня группировок, а также с ни проведения реакции, слован на новом свойстве арбоксипептидазы - У превлип свиньи в инсулин чел ультате обмена остатка ходящегося в положении еалин (источник та треонипа в среде С 07 К 3/08, А 61 К 37/26(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано дляполучения инсулина человека из инсулина свиньи. Цель изобретения - упрощение способа. Способ состоит в обработке производньгх инсулина инс-тре 1 ф ипс - тре-треН пли инс-тре-ОСНгде инс - дез-тре (В 30) в инсул человека, карбоксипептидазой У из дрожжей, которая катдлизирует обмен остатка дланинд в положении В 30 натреопин. В качестве источника треонина используют его прозводные, вчастности треониндмид Способ позволяет получить инсулин человека короткой, простой процедурой 2 табл. дные инсулина пнс-тр е-%1 или инс-тре-ОС з-тре(В 30) - инсули убируют с дрожжевой ой г и производным т 10,0. Предпочтительтреонина является акцию п ово ят в во л Р днои среде, которая может содержать до 507. объема органического растворителя, причем выбор растворителя зависит от растворимости компонентов реакционноХ. среды. Реакционная среда может также содержать мочевину илп хлоргндрат гуанидина в концентрации до 3 М Оптимальная концентрация инсулина 0,002-0,05 М, фермента 10 -10 М, треопипамида 0,05-3,0 М, температурао20-40 С. Эти параметры могут варьировать в широких пределах и определя - ются гкснеримептдльно.П р и м е р 1Пргз г 1 тецигз 1 ицогс инсулина в и(гсулзгц чзговек;1 с ивПОЛЬЗОВаЦИЕМ В КДЧЕСтВЕ;1 МИЦпоГО КОМпонента тероцицамицд и с и:зоп г(иег тзгромежуто гцггх ицсулинодмидов и 1(оспед лощая дездмидиздция 1 з соотгзетс г 1 иис изобретением,К раствору це содержащего цинкасвиного инсулина (2 мМБ в 2 мМ ЭДТЛ 100,1 М КС 1 и 1,5 М хлоргидрата гудцид гн, содержащего 0,5 М треониндмидд,-тре-ИН, ) при рН 7,5 и 25 С добавляют кдрбоксипептиддгзу-У (15 мкМБ,Значение рК в ходе реакции поддерживается в результате добавления 0,5 Мгидрата окиси натрия с использованием рН-стдта, В ходе реакции отбираю"гся апик 1 оты реакциоцной смеси в разное время, а сама реакция остацавлзггд тся в результате гашения спустя 2 чдоведением рН до 1,0-2,0 добавлением6 М раствора соляной кислоты Фрггкцию,содержащую инсулин, отделяют от эцзимаи низкомопекулярцых компоцентогз в 25результате хроматографирования нд колонке 1 х 30 см, заполненной "Сефадек -"ом Гмелким" с использованием вкачестве растворителя 1 М растворауксусной кислоты, и лиофилизируют ее. 30Проведенный согласно описанному вышеспособу анализ аминокисцотного состава лиофилизировацного инсулина показывает, что 787. свиного инсулина расходуется в ходе реакции. 35Дтгя дальней(1 его аналита реагентов,содержащихся в цинсулиновой пробе"проводят хроматографирование нд ионообменном зСег 1 ддексг(-1 ЕЛ. Л", Образец лиофипизированного инсулина 40(75 мг) растворяют в 001 М ТРИС,2,5 М мочевице, 0,05 М дС 1 при рН 7,5и хроматогрдфируют нд колонке, здцопненной "Сефадексом-ДЕЛ: Л" (2,5 хх 2,5 чсм) с использованием в качестве 45растворителя того же самого буферногораствора. Инсупг(н эпюируют растворамихлористого натрия с градиентом концентраций от 0,05 до 0.,30 М в том же буфере, собирают фракции по 8 мл на ко- .0лонке, заполненной "Сефддексом Г"и лиофилизируют их,Профиль состоит из трех пиков, Кроме того, определяются составы аминокислот и состав веществ пиков в резуль-.тате обработки кдрбоксппептидазотг (смтабл 1 Б.1 искотп ку в указанных реакциях угггствуют только С-конец цепи В инсулина,ц кдчест 1 е модели с 1 иного ицсули 1(д испол(,зуетсн послдогдт згьцость -г 1 розцз-.ш(д - ОН, Лцдтгоги(11 м обра.зом сокращецггг( для других производных инсуица представляют собой: -про-пи:з-тре-ОН дпя ицсупицд человека (-про-лиз-тре- БН ) Г(11 Я инсулиггдмидд человека и т, д, При рН 7,5, которое исг(ользуется в ходе реакции, при котором амида зная активность карбоксипецтидазы - У обьгчнониже, чем ее пептидазцая активность,обрдзющийся пецтицдмид 1 значительной мере стдбизген, поскольку цик 1сооттзетстгзует примерно 202 всего количества ицсулицовой пробыВ процессе реакции превращаетсяпример(го 75 Е исходного свиного ицсу:тицд. Однако, хотя содержание треоцинд гз пике 1 (3(з 5) больше, чем 3,0соответствуо(г(е( инсу;тину человека,ОЧЕГ 1(Г(11 О, ЧтО ПЕРВОЦДЧДЛЬЦЬтй ПРОДУКТтранспептидирования (-про-пиз-тре-Н Бце является достаточно стдбильцггм длятого, чтобы це ггроисходгггд опигоме -ризация с обрдзовацием (-про-лиз-тре 11 гБ"На первый взгляд образование смесипромежуточных амидов может говоритьо том, что в результате описанной ранее стадии дезамидирования посредством карбоксиг(ептидагзьгУ не образуетсячистый инсулин человека, поскольку врезультате дездмидпровация очевидноследует ожидать получения смеси -пропиз-тре-ОН и -про-лиз-тре-тре-ОН Однако при обработке вещества пика 1с целью дездмидирования согласно изобретегппо 10 мкМ карбоксипептидазы-У при рН 10,0 в 0,1 М НС 1, 2 мМ ЭДТЛ в течение 20 мин получают неогждднно практически чистый инсу:гин человека. Этот опыт протекает следующим образом,После отделения прореагировдвшего ицсуина от эцзима и низкомолекулярных продуктов хроматографированием ца "Сефадеггсе Г" полученный продукт хроматографирузот на "ДЕЛЕ-Сефадоксе А" с использованием способа, аналогично описанному вьшге. Продукт реакции элюируется в пике 11, что и ожидалось, тогда как непрореагировавший продукт (менее 1 ОЕ) злюируется в пике 1. Пик 111 вообще отсутствует, т.е, производные инсулина, не содержащие лизина, не образуются в ходе редкцз(и,. Б результате обработки карбоксипептидазами Л и г и трипсицом указанная реакция влияет тоггько на содер16112 жанне треонина в сколь-нибудь значительной степени. Это находится в соответствии с ожидаемым отсутствием пептидазной активности карбоксипептида 5зы-У при данном значении рНСостав аминокислот для пика 11,полученного при реакции дезамидирования, близко к составу инсулина человека: тре = 2,87, ала = 1,05,лиз = 0,98. Обработка продукта дезамидирования карбоксипептидаэами Уи Л и трипсином показывает, что образец содержит 90-96/ чистого инсулиначеловека Это утверждение сделано впредположении, что производное ин -сулина -про-лиз-тре-тре-ИН реагирует практически только при наличиигидролазной активности к пептидил 1 О 20 амиду аминокислоты, а - про-лиз-третре-ИН реагирует главным образомпри наличии амидазной активности,.Общий выход для превращения свиногоинсулина в инсулин человека составляет примерно 307 из расчета на превра -щенный инсулин 25 Таблица 1 Пик Лминокислота 30 1 11 111 11, полученный после дезамидирова 35 ния пик;, 1 17 6П р и м е р 2 РЕнсулинамид че 2ловека (инс-тре-ИН ) в количестве11 мг растворяют в 1 мИ ЭДТА и 2 мМ.ЕГ (2 мл), рН доводят до 9,0 добавлепем 51 мкл 0,5 И ИаОН и вводят всмесь 50 мкл карбоксипептидазы-У(13,6 мг/мл), Через 15 мин реакциюостанавливают введением 25 мкл 6 МНС 1, доводя рН до 1,2, Реакционнуюсмесь разделяют на "Сефадекс: Г"и элюируют 1 М раствором уксуснойкислоты. Получают 8 мг инсулина человека (доказано анализом аминокислотного состава)П р и м е р 3, 5 мг метиловогоэфира инсулина человека (инс-тре-ОСН )растворяют в 1 мл 0,1 М КС 1 с 1 мМЭДТЛ при повышении рН с 4,5 до 8,5добавлением ИаОН. Этот диапазон рНсохраняют в рН-стате с использованием0,05 М ИаОН в качестве титранта прикомнатной температуре. Реакцию начинают добавлением 1 мкг дроюкевой карбоксипептидаэы, растворенной в 10 мклводы За ходом реакции следят с помощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии. Спустя 1 ч 10 мин гидролиз завершается. Реакционную смесьподвергают гель-Фильтрации в 307.-нойуксусной кислоте на "Сефадексе Г.Выход, определенный с помощью А э,составил 4,8 мг человеческого инсулина.Лминокислотный анализ состав приведен в табл. 2,Та блица 2Аспарагиновая кислота 2,99 Треонин 3,62 Серии 2,93 ГлютаминоЛминокислота Содержание Содержание по формуле по анализу-",99 2,522,92 3,01 2,79 2,93 вая кис 6,88 1.00 4,00 1,16 0,94 2,42 5,80 3,80 7,16 0,98 4,00 1,52 1,04 2,82 6,21 3,86 7,01 0,87 4,00 1,09 1,192,50 6,10 4,02 7,18 0,71 4,00 1,03 1,09 2,81 6,18 3,67 2,64 1,89 1,01 0,89 2,65 1,93 1,06 0,98 2,74 1,960,990,96 аланииГистидинЛизинАригинин 2,82 1,90 0,74 1,00 лотаПролинГлицинАланинИдейцинВалинЛейцинТирозинФенилЛсп Тре Сер Глу Про Гли Лла Цис Валле Лей Тир Фен Гис Лрг Лиз 3 3 3 7 1 1 6 6 4 3 2 1 1 3,00 2,83 3,00 7,09 0,76 4,00 1,07 4,67 2,88 1,97 6,18 3,89 2,89 1,86 0,97 0,98Цр:)изво;сс тнессссо -:сато:сьскнй комбснат 11 атс. нт,;,Ужс,)ро,е, чс. :Ее.;сс)са 10 Изобретение позволяет утроститьизвестный способ получения инсу.синаЧЕЛОВЕКа И СОКРатИтЬ ВРЕМЯ ЕГО РЕа.сСзации за счет сокращения ;.псла тру 5доемких операций,Фс)рмула изобретения Способ получения инсул:сна человека путем обработки производных инсулина карбоксипептидазой с последующим выделением целевого продукта, о т :е и ч а ю щ е й с я тем, чт), с целью упрощения способа, в качестве произв)дых иесулееа исноль.уют иес тре % , инс-тре-тре-%1 или инс-тре-ОСН2 9 г;ее инс-дез - тре (В 30)-еесу 1 ие чело - века, а в качестве карбоксегеептидазы дрос)ссевую карбоксипееетиеазу-У, причем обрабОтку проводят ез растворе или дис - персии при рН 7,5-10,0.