Способ определения витамина в в цветочной пыльце

Ч - вытяжка цветочной пыльцы, вкоторой осуществляют окисление (5 мл);н - навеска образца цветочнойпыльцы,П р и м е р 2. Определение оптимальных доз ТХУ. 40х(А - А,): (В - В, Я Ч: (7 н,где А А,В В,3 1504599 фильтр У 40. Осадок отбрасьвают, а в фильтрат добавляют 2,5 мл 2,5 М раствора ацетата натрия до рН 5,0.Для осаждения белков в фильтрат объемом 24 мл добавляют 0,6 мл;207-ного раствора ТХУ, концентрация которого в фильтрате должна составлять 0,53, и инкубируют в течение 8-10 мин при комнатной температуре. Осадок от деляют путем центрифугирования при факторе разделения (Г), равном 255.102-367.347 (что при данных условиях соответствует 2800-4.000 д или 5.000-6.000 об/мин при расстоянии от оси вращения ротора до частицы 10 см) в течение 8-10 мин. Измеряют объем (Ч) супернатанта,Для перевода тиамина в тиохром (флуоресцентную форму) используют 20 окисляющую смесь: 0,047-ный раствор КГе(СИ) в 157-ном ИаОН, В 5 мл супернатанта (7 ) добавляют 3 мл окисляющей смеси, встряхивают в течение 30 с в мерной воронке. Далее прибав ляют 12 мл изобутилового спирта и опять встряхивают в течение 1 мин. Реакционную смесь оставляют на 10 - 15 мин в темноте для расслоения.Нижний водный слой отбрасьвают, а из 30 изобутилового слоя берут 10 мл, туда прибавляют 0,5 мл этилового,спирта и встряхивают до образования прозрачного раствора.Флуоресценцию раствора, измеряют при помощи флеориметра ЭФ-ЗМ, используя фильтры для определения витамина В. Содержание тиамина определяют по следующей формуле: показания флуориметра дляисследуемого окисленного раствора;показания флуориметра для исследуемого раствора после гашения флуоресценции тихромас 5 н, НС 1;показания флуориметра длястандартного раствора, в котором концентрация витамина В 1 /1 мл;показания флуориметра длястандартного раствора послегашения флуоресценции тиохрома с 5 н. НС 1;общая вытяжка цветочной пыльцы после центрифугирования(20 мл); Исследовали зависимость количества свободного витамина В отконцентрации ТХУ. Данные графика(фиг. 1) показывают, что существуетоптимальная концентрация ТХУ в фильтрате (0,5-1,07), при наличии которой в вытяжке цветочной пыльцы междуконцентрациями адсорбированного белками и свободного витамина В . устанавливается равновесие,Как показали исследования, полноеосаждение белков из фильтрата цветочной пыльцы при помощи ТХУ зависитот продолжительности инкубации ф"(фиг.З), Максимальное количествосвободного витамина В определяют припродолжительности инкубации 8-10 мин,Более длительная инкубация нецелесообразна, а сокращение времени инкубации приводит к неполному осаждениюбелков из фильтрата.П р и м е р 3. Определение оптимальных условий центрифугирования.Экспериментально установлено (фиг,4),что максимальное количество витаминаВ определяется в супернатанте призначении центрифугального поля равном 2.800-4,000 х д, что соответствует фактору разделения (Р ) 255. 102367.347 при радиусе ротора центрифуги 10 см, Оптимальное время центрифугирования 8-10 мин (фиг. 5). Такаяпродолжительность центрифугирования(как показали измерения оптическойплотности супернатанта при длине волны % = 540 нм, которой измеряетсярассеивание света частицами) обусловливает прозрачность супернатантаи полное осаждение белков, что является суще твенным для количественного определения витамина В 1.Применение предлагаемого способаопределения витамина В по сравнениюс прототипом позволяет сократитьвремя определения, так как исключаются такие операции, как нагреваниесуспензии перед и после добавленияТХУ, кроме того, отсутствует стадияудаления примесей, повысить точностьопределения ввиду повышения качестваисследуемых растворов (фильтрование5 , 504599 6через стеклянный фильтр и центрифу- ч а ю щ и й с я тем, что, с целью гирование) и наименьших потерь вита- ускорения и повышения точности спомина Вт. соба, суспензию Перед добавлением5ацетата натрия фильтруют затем пос 1ф о р м у л а и з о б р е т е н и я ле обработки ацетатом натрия к фильтСпособ определения витамина В рату добавляют трихлоруксусную кисло- в цветочной пыльце путем ее суспен- ту до концентрации 0,5-1,07 и смесь дирования в соляной кислоте, добавле- инкубируют 8-10 мин затем отделяют ния ацетата натрия, обработки железо полученный осадок центрифугированием синеродистым калием в щелочной среде при 2800-4000 8 в течение 8-10 минс последующим измерением флуоресцен- а супернатант обрабатывают зелезоции в сравнении с контролем, о т л и- синеродистым калием.Составитель А. ПоповТехред М.Дидык Тираж 789 Подписноевенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5