Способ определения содержания кронетона в сыворотке крови

ОЮЗ ССВЕТСНИ ОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 19) 1111 40 3/49 ьГАИ 311.1 Л ПЦЕНТЫ 4-; . "11, Бй Б",. " ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНЯ А ВТОРСИОМУ 680 ДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕ КРОНЕТОНА В С 11 ВОРО (57) Изобретение о мии. Пробы обрабат спиртом при соотно рифугируют. Измеря минесценции суперн ют спектры контрол 205760/2 6.04.87 7.03.89. осковскинститут(21) (22) (46) (71) ский мана (72)- 14 ЛЕНИЯ СОДЕРЛАНИЯТКЕ КРОВИтносится к биохиывают этиловымшенин 1:9 и центют спектр фотолюатанта, Сравниваьной и опытной 1 Ф 9 учно-иБ й тель Ф.Ф и иены иь вская, М,А.Ил и В.В.Некрасо И Л Гриц оварский 612,015( В.Я (53 88проб и проводя ние по интенси двоиное нормированости излучения, Коона находят по калиличество кроне бровочной крив 3 табл. ниябработки пол в определециональной щади междот олюмиГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯПРИ ГКНТ СССР Изобретение относится к экспериментальной токсикологии, а именно к количественному определению содержания пестицида кронетона в сыворотке крови лабораторных животных.Цель изобретения - создание селективного способа определения кронетона в сыворотке крови.Цель достигается путем извлечения кронетона из сыворотки, осаждения белков сыворотки, центрифугирова записи спектра люминесценции надосадочной жидкости, последующей обработки полученного спектра и сравнения полученных результатов с заранее построенной градуировочной кривой.Оптимальные условия фотолюминесценции кронетона в растворителе -о96 -ном этаноле: максимум испускания наблюдается при 1= 310 нм, если А возбуждающего света 235 нм. Сывор от ка кр ови жи в от ных, о бра бота инаяо96 -ным этанолом (т.е., надосадочная жидкость после осаждения белков этанолом и центрифугирования), дает . Св максимум фотолюминесценции на уровне 340 нм при 1 возбуждающего света 235 нм, т.е. в другой спектральной области. Сыворотка крови животных, Фей содержащая кронетон, обработанная ф добавлением этанола, дает сложный спектр с максимумом фотолюминесцен- р ции на уровне 340 нм и сильным до- ю пдлнительным (по сравнению со спектром сыворотки крови без кронетона) свечением в области 300-320 нм при Л возбуждающего света 235 нм, т.е, данный спектр представляет собой суперпозигдю спектров фотолюминесценции сыворотки крови и кронетона, где вклад в коротковолновой части спектра дает люминесценцию самого кронеЗв тона.Принцип о ученных спектров состоит нии величины Я, пропор пло У нормированными спектрами фнесценции сыворотки крови с кронетоном и без него в области Л = 300320 нм. Определение содержания кронетона Я в сыворотке крови по измеренным спектрам фотолюминесценциипроизводится следующим образом: призначениях Л = 300, 305, 310, 315,320 нм определяют значение функции31,/Л/ иу /Я / ееи аеюид /л/где 1, /Л / - значение интенсивностифотолюминесценции в пробе сыворотки крови, содержащей кронетон",1 /Л/ - значение интенсивностифотолюминесценции в пробе сыворотки без кронетона;и - коэффициент, получаемыйпри делении максимального значения интенсивности Фотолюминесценциисыворотки крови (при Л =340 нм) на максимальное значение интенсивности Фотолюминесценцииобразца сыворотки крови,содержащей кронетон (при- 340 нм).Величина Ц/3/ определяет при каждом Фиксированном значении 1 нормированную разность интенсивностейспектров фотолюминесценции сыворотки с кронетоном и беэ него.Затем находят величину Б: Б =:Ц 300 нм + 2 М 305 нм +2 Ч 310 нм ++2 Ч 315 нм + Ч 320 нм, а по ней определяют значение Б (содержание кронетона), используя заранее построеннуюградуировочную кривую 1 Я/БИ/Б/ = 1,8 10 " Б "ф,.Ы 1:= моль/л.При построении градуировочной зависимости использованы результаты независимых измерений 54 модельных смесей растворов кронетона с известной концентрацией и сыворотки крови,Метрологическая характеристика способа. Воспроизводимость оценивается величинами стандартного (Б) и относительного стандартного отклонения (Б ), расчитанными по формулам 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ББхПравильность оценивается по величине погрешности единичного измере-. дИния - = 807., Диапазон концентрацийИкронетона, определяемых предлагаемымспособом, 10- 10 " моль/л (0,002250,225 г/л). Результаты проведенныхизмерений удовлетворяют статистическому критерию содержательностисоп.=:26 ) 4 Р, =15, характеризующему надежность или предсказательность модели.Средние значения (по результатамнезависимых измерений) для смесейкронетона с сывороткой крови приразличном содержании препарата приведены в табл, 1.Опытным путем установлено оптимальное соотношение сыворотки кровии этанола 1:9. Прибавление меньшегоколичества спирта (1:7, 1:5) не полностью осаждает белки и надосадочнаяжидкость остается мутной, большаядоля этанола приводит к чрезмерномуразбавлению вещества, Результатыизмерений (табл. 2) Б и И (И - концентрация кронетона в модельной смеси, в данном случае равна 10 Э М/л)показывают, что применение соотношения сыворотки и спирта 1:8, 1:9,1:10 дает близкие результаты, а отношение 1:7 и 1:11 вызывает большуюпогрешность измерений,П р и м е р 1. Белойкрысе массой 200 г внутрижелудочно вводяткронетон в количестве 60 мг (доза300 мг/кг). Через 15 мин у животного берут 1,5-2 мп крови и центрифугируют для отделения сыворотки. Затем отбирают пипеткой 0,5 мл сыворотки крови, помещают в центрифужную пробирку, добавляют 96 -ный этанол до объема 5 мг, встряхивают дляэкстракцни кронетона спиртом и удаляют осажденные белки центрифугированием в течение 15 мин (скорость1500 об/мин). Далее измеряют спектрФотолюминесценции прн д возбуждающего света 235 нм (и данном случае используют Флуоресцентный спектрофотометр марки МРГРепй 1 п-С 1 шег, измерения проводят при размере щелей3 и 8, усилении 3). Аналогично обрабатывают кровь от интактного животного, не получившего кронетон, и измеряют спектр фотолюминесценции на1464084 досадочной жидкости при / возбуждающего света 235 нм, Данный спектр служит внутренним люминесцирующим стандартом при определении концентра 6 ции кронетона в опытной пробе,Далее проводят двойное нормирование по интенсивности излучения в целях преодоления разброса показателей. Определяют коэффициент и путем 10 деления интенсивности фотолюминесценции в максимуме полосы контрольной пробы (при Л = 340 нм) на интенсивность фотолюминесценции в максимуме полосы опьггной пробы (также при 1 я Л = 340 нм): Затем находят величину Б по формуле: Б = 4300 нм +2 ч 305 нм++2 М 3 О нм +2 315 нм + сг 320 нм,т.е. 1,6+11,6 +26,8 +26,92 +6,367, 22,Пользуясь градуировочной зависимостью И от Б находят, что концентрация кронетона в опьггной пробе сос"тавляет 1,5 10 моль/л. Учитывая,что сыворотка крови разбавлена в10 раз, концентрация кронетона в сыворотке крови равна 1,5 10 моль/л=0,034 г/л или мг/мп). Фор мула из о бр ет ения 13 8и = - -г - = 2 65. 5,2 Способ определения содержания кронетона в сыворотке крови, включающий обработку пробы этиловым спиртом при объемном соотношении проба:спирт 1:9, отделение осадка с последующими измерением фотолюминесценции супернатанта, обработкой спектра в сравнении с таковым в контрольной сыворотке, определением площади пика в области длин волн 300-340 нм и расчетом количества кронетона по калибровочной кривой. Пользуясь формулой 20 численный множитель 100 вводят дляудобства вычислений), находят 4/Д /при значениях Л 300,305,310,315 и320 нм, т,е. в области, где наибольший вклад дает фотолюминесценция самого кронетона, Данные приведены втабл, 3. 30 Та блица 1 Концентрация кронето- Площадь, БО /,на в пробе И, моль/л усл. ед. Стандартное Относительотклонение,Б ное стандартное отклонение, Бг Та блица 2 Соотношение сы 1:8 1:9 1:10 1:11801 824 796 712 1:7 705 воротки и этанола Площадь, Б, усл. ед. 1 102,5 .105-107,5.101 -105 .10-45 107,5 10 4Заказ 819/48 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,Ужгород, ул. Гагарина, 101 300 305 310 315 320 37,1 50,3 67,5 83,4 97,6 36,5 47,5 59,5 75,5 91,0 1,65,813,410,466,3